肝糖原实验讲义.doc

肝糖原实验讲义,1,生物化学实验考核卷姓名,专业,级班组,月日,星期一、实验题目肝糖原的提取、鉴定与定量二、,了解其注意事项。、糖原和葡萄糖鉴定与蒽***比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。。(视具体情况,采用合适的混匀方法)。。。二、实验原理(一)肝糖原的提取、鉴定糖原储存于细胞内,采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三***醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95,乙醇将滤液中糖原沉淀,再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的存在。CuSO4十2NaOH?Na2SO4+Cu(OH)2?2Cu(OH)2十C6H12O6?2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O2CuOH?Cu2O?(红色)+H2OCu(OH)CuO?(黑色)+H2O(二)肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟***呋喃甲醛,此化合物再与蒽***脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10?100)?g范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色,通过标准对照法(直接比较法)即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其它成分,而保留肝糖原。三、实验材料(一),室温?100?恒温水浴箱(×2),722型分光光度计,精度为10mg级电子天平(×1)(×1),镊子(×1),研钵(×1)(×1),10mL离心管(×2),(100×15)mm试管(×6)(2mL×1,5mL×2),1000μL微量可调取液器(×1)(×1)(×1)(二)。,乙醇。(5,)三***醋酸溶液:称取未潮解的三***醋酸(C2HCl3O2,)5g,加蒸馏水溶解至100mL。:。,2,:浓HCl原液(36%?38%)。(50,)NaOH:称取NaOH50g,用蒸馏水溶解至100mL。:碘l00mg和K1200mg溶于50mL蒸馏水中。:称取柠檬酸钠(C5H5Na3O7?5H2O,)(Na2C03,)100g溶于蒸馏水700mL中,加热促溶。冷却,,硫酸铜(CuSO4?5H2O,)l00mL,边加边摇。再加蒸馏水至1000mL,混匀,如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。(30,)KOH溶液:称取KOH30g,加蒸馏水溶解至100mL。1