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生化分离工程第二章第二章生化分离技术生化分离技术破碎缓冲液?-,pH为7-8的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液(与细胞内环境相似)抗氧化剂:含二硫键的蛋白质,细胞内:高度还原;外界氧化环境。,2-巯基乙醇2-BME,半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH (还原型)酶抑制剂:针对性添加,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯基蛋白酶抑制剂碘乙酸、金属蛋白酶EDTA,etc?PVP:植物组织的破碎过程化中常用聚乙烯吡咯烷***PVP吸收酚类物质(酚类物质会与蛋白质结合形成沉淀)细胞破碎(Cell disruption)??细胞的结构细胞的结构??动物动物//植物和微生物植物和微生物::前者没有细胞壁,只有脂质前者没有细胞壁,只有脂质和蛋白质构成的柔软的细胞膜,易于破碎和蛋白质构成的柔软的细胞膜,易于破碎??细菌:细菌:革兰氏阳性菌的细胞壁比阴性菌的细胞壁革兰氏阳性菌的细胞壁比阴性菌的细胞壁坚固坚固WhyWhy??较难破碎。较难破碎。??酵母或其他真菌:酵母或其他真菌:胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多糖和蛋白质构成,比革兰氏阳性菌的胞壁厚糖和蛋白质构成,比革兰氏阳性菌的胞壁厚?G+:典型金黄色葡萄球菌,肽聚糖60-95%?G-:,肽聚糖10%?不同类型细菌的细胞壁结构成分:较高0蛋白质约20%一般无类脂质0有磷壁酸10%60-95%肽聚糖G-G+细胞壁组成?酵母菌:由甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖组成的“三明治”结构, 细胞破碎技术??细胞破碎的目的:细胞破碎的目的:使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏(增大通透性)或破碎,释放其中的目标产物(增大通透性)或破碎,释放其中的目标产物机械法非机械法珠磨法、压榨法高压匀浆、超声破碎、撞击法固体剪切作用液体剪切作用1)酶溶法2)化学法3)物理法干燥处理溶胞作用超临界细胞破碎1、机械方法破碎?1)珠磨法(bead milling):细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻璃小珠、石英砂等一起高速搅拌,细胞与研磨剂之间相互碰撞、剪切,使细胞达到某种程度破碎,释放内含物??可采用可采用间歇式间歇式或或连续连续操作珠磨机操作珠磨机??增加增加装珠量装珠量、延长、延长破碎时间破碎时间、提高、提高转速转速等手段可提高破碎率等手段可提高破碎率??→→总能耗增加且须注意换热总能耗增加且须注意换热??适用于多数微生物细胞,适用于多数微生物细胞,(藻类和真菌菌丝)(藻类和真菌菌丝)和和质地坚硬质地坚硬(亚细胞器)(亚细胞器)的微生物细胞的微生物细胞2)高压匀浆法(high-pressure homogenizationhigh-pressure homogenization)??破碎原理:破碎原理:利用高压使悬浮液通过针形阀,从阀座与阀之间的利用高压使悬浮液通过针形阀,从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上,细胞在受到高速撞击后,急环隙高速喷出后撞击到碰撞环上,细胞在受到高速撞击后,急剧释放到低压环境剧释放到低压环境??破碎作用力:破碎作用力:突然减压和高速冲撞突然减压和高速冲撞阀座阀撞击环??操作参数少且易于确定,操作参数少且易于确定,实验室实验室及工业及工业生产中均可生产中均可??适用于适用于酵母和多数细胞酵母和多数细胞的破碎的破碎??对易造成堵塞的对易造成堵塞的团状或丝状真菌团状或丝状真菌及一些易损伤匀浆阀、及一些易损伤匀浆阀、质地坚硬质地坚硬的亚细胞器的亚细胞器一般不适用一般不适用33)超声波破碎()超声波破碎(ultrasonicationultrasonication))??机理:机理:高于高于20kHz20kHz的的超声作用下产生的空穴化作用,空穴由于超声作用下产生的空穴化作用,空穴由于超声波的冲击而产生和闭合,产生极大的冲击波和剪切力。超声波的冲击而产生和闭合,产生极大的冲击波和剪切力。缺点:缺点:AA、、影响因素多,细胞种类、浓度影响因素多,细胞种类、浓度和处理时间、探头材料和形状;和处理时间、探头材料和形状;BB、、有效能量的利用率低;、、产热大,需控温;产热大,需控温;DD、、不易放大,仅应用于实验室规不易放大,仅应用于实验室规模的细胞破碎。模的细胞破碎。机械破碎法总结机械破碎法总结??以上几种机械破碎法的作用以上几种机械破碎法的作用机理不尽相同机理不尽相同,有,有各自的适用范各自的适用范围围(包括菌体细胞、细胞发酵液的特性)和处理规模(实验(包括菌体细胞、细胞发酵液的特性)和处理规模(实验室或工业用)室或工业用)细菌细菌酵母菌、细菌酵母菌、细菌酵母、藻类及丝状真菌酵母、藻类及丝状真菌适用对象适用对象实验室实验室实验