实验七细胞固定与染色技术教学讲义.ppt

实验七细胞固定与染色技术我的邮箱bucmedu.@一、,失去正常的成分,结构被破坏,甚至坏死;而对细胞的观察和操作大多是不能直接在培养环境中进行的,所以要对细胞进行固定,从而最大程度的保持细胞生活时的状态。其主要原理就是用相应的固定液使细胞内的蛋白质变性、硬化,保持生活时原有的成分和结构。,所以通常观察到的细胞都是透明的,细胞的内部构造和成分都隐藏在背景当中,借助物理或化学的方法对细胞进行染色能够增强观察对象与背景的区别,帮助我们进行定性或定量观察。二、固定目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来,固定细胞的方法有:1. 物理固定:如血膜空气快速干燥、冷冻干燥或直接冷冻切片。2. 化学固定:如甲醇、乙醇、***、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构中的某些物质加以固定保存。不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活性的影响、保存结构的细腻度均不相同。因此,要根据实验要求和组化反应,选择最佳的固定方法和固定剂。如显示多糖常用乙醇固定,而显示酶类多用甲醛***缓冲液固定。:为阳离子染料,能接受质子,染细胞核的染料。如亚甲蓝、天青。:为阴离子染料,能释放质子。主要有荧烷-氧杂蒽染料和偶氮染料两类,能结合细胞的碱性成分并染色,如血红蛋白、嗜酸性颗粒成分等。:同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料(一)、染料(天然染料和人工染料):将生物组织细胞和病原体染色,在显微镜下观察结构。发色基团和助色基团使生物学染色剂产生颜色和被染组织亲合。细胞染色技术(三)、:经物理和/或化学作用的吸附、:荧光染料,::用化学反应显示细胞内某种成分。细胞免疫化学染色法(应用单克隆抗体技术、酶标记技术)(eosin,E-)碱性染料亚甲蓝(methyleneblue,M+;又名美蓝)组成复合染料。甲醇:溶解美蓝和伊红ME;固定细胞的形态;提高对染料的吸附作用。注意:pH值的影响细胞各种成分多属蛋白质,由于蛋白质系***电解质,所带电荷随溶液pH而定。在偏酸时正电荷(H+)增多,易与伊红结合,染色偏红。在偏碱时负电荷增多,易与美蓝或天青结合,染色偏蓝。染料贮存时间愈久,染色效果愈好。染液贮存,必须加塞,以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。加入甘油,防止甲醇挥发,染色清晰。瑞氏染色法(二)、:,:有强大的脱水力,可将细胞固定为一定形态,并使蛋白质沉淀为颗粒状、网状等结构,增加细胞与染料接触表面积,提高对染料的吸附作用,增强染色效果。(PBS):磷酸二氢钾(无水),磷酸氢二钠(无水),蒸馏水加到1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH,塞紧瓶口备用。染色方法:,平放于染色架上。,固定1min。,混匀,染色5-10分钟。,待干后镜检。染色流程:勿冲洗再加瑞氏染色Ⅱ液5-8滴后将Ⅰ液和Ⅱ液充分混允静置10分钟直接流水冲洗3-5分钟(切勿先到掉染液)涂片经水洗干燥后用油镜分类计数100个白细胞李四123固定干燥后加瑞氏染色Ⅰ液5-8滴覆盖整个血膜1分钟