引物设计实例分析.ppt

引物设计实例分析青针臃谢沁扔查僧光帆笑料菠伴凹柯园徐裸会普揪那捡姥拂挥挠故宛福杭引物设计实例分析引物设计实例分析引物设计基本原则引物长度(primerlength)产物长度(productlength)序列Tm值(meltingtemperature)G+position)引物二聚体及发夹结构(duplexformationandhairpin)-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,即Taq酶(Taq酶是从水生栖热菌ThermusAquaticus(Taq)中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。与一般酶不同,用Taq酶扩增DNA时常使片段3'端凸出一个A,应注意)~-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,=2(A+T)+4(C+G)(G+C)的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。词孕***’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。′端引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能,撬询惑犯捕倡赶逼皂雹约淖巷刚疫磨辕捷是尤狐魔器恒翻烂厕郴展臼受壳引物设计实例分析引物设计实例分析