全反式维甲酸诱导神经母细胞瘤分化及其TrkA剪接异构体表达研究.pdf

个人简介????????????????????????????.30·中文论著摘要·全反式维甲酸诱导神经母细胞瘤分化及TrkA剪接异构体表达的研究目的神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童常见的交感神经系统的恶性胚胎源性肿瘤。其临床表现及基因表型均具有高度异质性。酪氨酸激酶受体A(TrkA)在神经系统的发育和成熟中占有重要的地位,对NB细胞生长、分化及凋亡有重要的调节作用。既往认为TrkA是NB预后良好的标志,但在作者所在研究组对TrkA进行研究时发现,一些高表达TrkA的NB却具有更具侵袭性的肿瘤行为并易发生早期转移。最近文献报道了NB中存在与已知的两种TrkA剪接异构体TrkAI及TrkAII功能相反的剪接异构体TrkAⅢ,TrkAm可促进NB侵袭性生长,增加NB细胞耐药性。这就为某些NB高表达TrkA却具有更强侵袭性的原因提供了解释。全反式维甲酸(all-trans—retinonicacid,触限A)能够在体外诱导NB细胞分化,并抑制细胞增殖,可用于建立SH-SY5Y细胞的分化模型。目前国内外对TrkA[[I的研究均未广泛开展,对眦ⅡI的产生及作用机制尚未明确。,研究ATRA对NB细胞的增殖抑制与诱导分化作用,。这在国内外文献未见报道,本研究将为进一步研究TrkAIⅡ剪接亚型的产生及作用机制提供新的理论依据。方法一、细胞培养,形态学观察及细胞计数将SH-SY5Y细胞进行复苏培养,取对数生长期细胞,培养24h后分为实验组及对照组,、,对照组不加任何药物,分别于细胞培养的第1,3,5和7d利用台盼蓝拒染计数活细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。二、、、10I-tmol/L的ATRA处理1、3、5、,提取总RNA,按试剂盒说明书配置逆转录反应体系合成cDNA;弓I物由Takara公司设计合成,采用SYBR船enI实时定量荧光PCR方法,以GAPDH为内参照,进行SYRBGreenI实时荧光定量PCR,检测TrkA三种剪接异构体的表达水平。三、结果判断将标准品eDNA8倍浓度梯度稀释为5—6个浓度梯度,各取2此作为模板进行RealT'unePCR反应,由各扩增曲线得到的CT值制作标准曲线,从而得到样本的拷贝数。以GAPDH作为内参照,TrkAI/II和TrkAIII作为目的基因,通过目的基因和内参基因拷贝数的比值进行样本问相对定量的比较。四、。实验结果用(x士s)表示,各组间均数比较用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P<。多士里耋口7卜一、方法的可靠性和准确性l、RNA的纯度和质量分析所提取的总RNA经紫外分光光度计检测,—,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,条带清晰可见,无明显降解。2、扩增的特异性及定量的准确性标准品eDNA经梯度稀释后进行PCR反应,制作标准曲线。得到的标准曲线相关系数矿)均>,,反映定量准确,扩增效率良好。扩增后溶解曲线显示锐利的单一锋,无其他非特异性锋,说明扩增产物均一,无非特异扩增及引物二聚体。琼脂糖凝胶电泳进一步验证扩增片段的均一性及长度。二、,。。三、,对照组细胞分化百分率随时间延长无明显变化,各时间段间比较差异不显著(F--,P---)。四、,TrkAI/IIrnRNA表达水平增加与ATRA浓度及作用时间呈正相关。TrkAllIrnRNA表达增加与ATRA浓度及作用时间呈负相关。,,随时间延长细胞出现明显的分化特征。再增加ATRA浓度,;,TrkAI/II表达与ATRA作用的时间、剂量上呈正相关关系;随着ATRA作用浓度及作用时间的增加,TrkAllImRNA表达降低,并呈现一定的相关性。关键词