MTT法原理步骤.doc

MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法,该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济,但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测,这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。一、检测原理MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide,汉语化学名为3-(4,5-二***噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(商品名:噻唑蓝),是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二***亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值(也有用570nm波长),可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。二、试剂材料准备与实验仪器1、对数生长期细胞2、受试因素(药物)3、-1MTT溶液:,溶于100ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中(60℃水浴助溶),,放4℃避光保存即可,在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。(PBS配方:NaCl8g,,,,,定容1L)4、DMSO(二***亚砜)5、96孔板6、酶联免疫检测仪7、细胞培养箱三、MTT法实验步骤(一)普通MTT法实验步骤1、接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,、培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。3、呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制,pH=),终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ulDMSO,脱色摇床振荡10min,使结晶物充分融解。4、比色:选择490nm(570nm)波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。(二)药物MTT法实验步骤1、贴壁细胞(1)收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100µl,铺板使待测细胞调密度至103-104cell/孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。(2)5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药,一般5-7个梯度,每孔100µl,设3-5个复孔,建议设5个,否则难以反应真实情况。(3)5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。(4)每孔加入20µlMTT溶液(5mg/ml,%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。(5)终止培养,小心吸去孔内培养液。(6)每孔加入150µl二***亚