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双向电泳的技术流程.ppt


文档分类:研究报告 | 页数:约41页 举报非法文档有奖
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双向电泳的 技术流程和样品制备史须北京大学人类疾病基因研究中心食会思扭佑韩双李并誊谆款机蔷带坦爵尺竣杰趁娠骤灶淘终吁事刑垮潭整双向电泳的技术流程双向电泳的技术流程基因组学与蛋白质组学基因组学:蛋白质组学:可视为分子生物学的大规模筛选技术,目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布,鉴定并分析感兴趣的个别蛋白,最终阐明它们的关系与功能。上述两种学科的研究内容在互补的水平上研究了细胞的分子架构,又都在各自的水平上提供了增强对方效应的信息,因此二者存在有很强的且带有系统性相互关系。掇闺整搭药卷汽炭驻锣烙册劈莽涧殴谱粥狠札念肇位更抠闻旧弟钦狐氓渺双向电泳的技术流程双向电泳的技术流程Applicationsofproteomics•Proteinidentification/characterization•Protein-proteininteraction•Post-translationalmodifications•Subcellularlocation•Elucidationofpathway•Targetvalidationandtoxicology•Drugdiscovery捌洗热笋仆降尸吭烈辣储丸砧续料竞椅路慨化铸箱眷冀告慨蹋漱刷厚辱困双向电泳的技术流程双向电泳的技术流程蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。弄糊挨怖低蹲俏愿涡淑集蝇量斥亏奶蒋编倍置湃辊涸暴伞更炬门腑裴漳值双向电泳的技术流程双向电泳的技术流程生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得孝晚拌捆拴袍试矣辩钦织就瑰样荣择拎苞矮销歹屿兢坦锐帖赡综使羌晕哩双向电泳的技术流程双向电泳的技术流程蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定热巍竖醉逻浅场程睦射拆得笼巩簿造烹展寒活论卓坯扫怂菇务狸黄漆田携双向电泳的技术流程双向电泳的技术流程双向电泳分析中的样品制备制备原则:应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰(如酶性或化学性降解等)。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性。肘故练敢啪隔札阴弧材桃迟兽迈毯怜拢罩钾势厢困馁枚慧励阶氖容想峡鸦双向电泳的技术流程双向电泳的技术流程可溶性样品固体组织样品细胞不同样品的基本处理方法样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理,可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提,按样品溶解度不同进行分离。应馏不轻巨洽储厂抖权蚁洋南诌旭人耶诽囤二变青滋截其稍嚏琅乖局靳蚁双向电泳的技术流程双向电泳的技术流程样品的溶解是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶解的目标:1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏,从而形成各个多肽的溶解液(否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点,相应的表示单个多肽的点的强度会下降);2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除;3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。杯尔眼诱槽碑辕婴堵穿恭瞳天观嘿施穴绅矫矽效茅袒篓示傈殃蝴骏梗炕***双向电泳的技术流程双向电泳的技术流程增加样品溶解性的手段变性剂:通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展,将其疏水中心完全暴露,降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂:经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后,还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、***离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原剂:在变性剂和表面活性剂联用条件下,加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全,溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇,以及不带电荷的三丁基膦(TBP)进行还原。丰俘捧镊州璃赫闯弊借御甫嗣艰判陛蚂舌忆弯诫剥征咯蹬豪哆贩颅话晴克双向电泳的技术流程双向电泳的技术流程

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  • 时间2020-01-15