病毒TCID50测定模板.doc

病毒TCID50测定病毒TCID50测定操作步骤(1)准备细胞取出一块细胞培养板,每个孔大约传8000~10000个细胞(一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板,要传匀)。每个孔的细胞铺成单层大约60%丰度即可接种病毒(下午传好板第二天早上就能用)。细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照能够在一块培养板上进行,操作中注意不要窜孔。也能够分别在不同的细胞培养板上进行,但要保证实验条件一致。(2)稀释待测病毒液。A法为参考书上标准的操作方法B法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体,无论哪种都无血清。。,依次10倍系列稀释至适宜浓度,最后一支试管。B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1,10-2…10-10等),根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定能够多稀释几个滴度。根据接种的孔数稀释病毒,常规每个稀释度接种4孔,则每个稀释度配500µl,即10-1为50µl加入450µl的孵育液中;如每个稀释度接种8个孔,则各配制1ml,即10-1为100µl加入900µl孵育液中。若接种8个孔,则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的,能够根据接种的量自行调整。【!此步操作注意事项:1)建议每个稀释度接种8个孔,若要统计分析则还要增加至16个孔。2)病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。2)此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器,并用紫外线照射20min,确保无菌。使用新高压的tip头,外包装一定在超净台(或安全柜中打开)。】(3)接种取细胞培养板,用多道加样器(又称排枪)吸去96孔板中的培养液,吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次,然后吸出孵育液(此步目的是去除血清,因为血清能干扰病毒的吸附)。将稀释好的病毒液加到96孔板上,每孔100µl,根据观察的****惯,一般从右到左,从上到下,从高稀释度到低稀释度(10-1,10-2)到原液加样。【切记:设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次,计算标准差。】37℃CO2培养箱中孵育1h,取出培养板吸去病毒液(从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔),加入维持液200µl继续在37℃CO2培养箱中培养。(4)培养将培养板放置于CO2培养箱。培养温度    ,培养   天。(5)测定结果取出培养板,显微镜下观察细胞病变。计算方法1)Spearman-Karber法   ID50/=-(X0-d/2+d×∑R1/N1)       X0=全部病变最低稀释度对数    d=稀释因数对数    N1=每个稀释度所种的孔数    R1=病变孔数                      ∑=ID50/ml=ID50/+2)Reed-Muench法观察CPE,找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数,按计算出该病毒液的TCID50TCID50是指组织培养物(细胞)半数致死计量。它有几个性质我们必须明白:1)它表示的是计量,不是浓度;2)它是一个单位;3)它的值等于1,实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题,就像问km的值等于多少一样,如果非要说出的的值等于多少,那我们只能说它的值在任何情况下都等于1。理解这三个性质对于理解TCID50非常重要,但是这三个性质经常被误解,所以导致对TCID50的理解出现偏差。首先我们来看一下这个表示法的意