金雀异黄素的抗肿瘤及其和辐照联合效应作用机制研究.pdf

23金雀异黄素的抗肿瘤及与辐照联合效应作用机制的研究中文摘要I中文摘要研究背景:大豆异黄酮是富含于大豆中的植物雌激素,其中金雀异黄素(Genistein)生物活性最强。体内外研究均证实大豆异黄酮能减少激素依赖性肿瘤乳腺癌和前列腺癌发病率,是一种很有前景的防治癌症的天然化学物质。已知激素替代疗法有助于降低绝经女性结肠癌的发病风险,因此开展对植物雌激素的大豆异黄酮在结肠癌中的防治作用的研究具有重要的意义。另外,作为肿瘤的放射治疗在临床上可联合应用手术、化学或激素治疗,为了提高局部控制以及生存期,放疗联合放射增敏试剂是一种针对癌症的有效的治疗方法,大豆异黄酮在其中所起的作用也值得关注。目的:研究大豆异黄酮对结肠癌和乳腺癌的抗癌作用及大豆异黄酮对结肠癌和乳腺癌的辐射增敏作用。方法:细胞株选用人结肠癌细胞HCT-116和乳腺癌细胞MDA-MB-468,细胞于DMEM培养基中常规培养传代。除非特别交代,金雀异黄素的实验浓度定为0、25、50和100μmol/L。采用MTT法测定细胞存活率、流式细胞术分析细胞周期的分布、Western blot法测定相关蛋白的表达、磷脂酰丝氨酸外翻法(Annexin V-PI双染法)分析金雀异黄素对细胞凋亡的影响;细胞内ROS的影响(DCF法)和线粒体膜电位的变化(JC-1法)采用试剂盒检测;采用透射电镜下观察细胞超微结构的改变;金雀异黄素对肿瘤细胞的侵袭转移的影响,采用Transwell实验、细胞粘附性实验以及免疫荧光法测定E-钙粘附蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶(MMP2)的变化进行研究。金雀异黄素对肿瘤细胞放射敏感性的初步研究选用无毒性25μmol/L的金雀异黄素处理细胞,联合X射线对细胞进行辐照。采用克隆形成实验计算细胞存活中文摘要金雀异黄素的抗肿瘤及与辐照联合效应作用机制的研究II分数、流式细胞术检测细胞周期和细胞的凋亡、并用Western blot法进一步检测金雀异黄素预处理对照射后细胞内DNA损伤修复相关蛋白表达的调节作用。结果:1. 结肠癌HCT-116(1) 金雀异黄素对HCT-116细胞增殖有明显的抑制作用,并呈浓度和时间依赖关系,抑制50%细胞生长的剂量(IC50)(24 h)。0、25、50和100 μmol/L金雀异黄素处理后出现了明显的G2/M的周期阻滞,±%±%。进一步的机制研究发现,金雀异黄素处理降低了细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinH表达,对CylinD3、CyclinA、CyclinE的表达无明显影响。(2) 金雀异黄素处理HCT-116细胞后,Annexin V/PI双染法结果显示早期凋亡细胞比例随浓度增加而上升,晚期凋亡细胞也略有增多。特征性的Sub-G1凋亡峰随处理浓度的增加而增多。100μmol/L金雀异黄素处理2 h后细胞内ROS水平达峰值,(±% vs ±%),然后逐渐下降。100μmol/%,以后虽略有回升,但维持在极低的水平。与凋亡相关的P53蛋白出现升高,并且抑凋亡蛋白Bcl-2出现了下调,促凋亡蛋白Bax出现了上调。透射电镜下,金雀异黄素处理后细胞呈现不同程度的凋亡和自噬性改变。(3) 100μmol/±%,±%,即金雀异黄素显著降低粘附能力。Transwell结果显示0、25、50μmol/±50、407±、±,即侵袭转移能力逐步下降。荧光显微镜下100μmol/L金雀异黄素处理后细胞质中E-cadherin荧光强度变强,MMP2抗体荧光强度变弱。-MB-468细胞(1) 金雀异黄素对MDA-MB-468细胞增殖也有明显的抑制作用并具有浓度和时间依赖关系,(24 h)。0、25、50μmol/L金雀异黄素处理后G2/±%±%,100μmol/±%,表明低浓度时(<50μmol/L)引起G2/M期阻滞。(2) Annexin V/PI双染法分析显示100μmol/L金雀异黄素处理后晚期凋亡细胞金雀异黄素的抗肿瘤及与辐照联合效应作用机制的研究中文摘要III有所增加。特征性的Sub-G1凋亡峰随着处理浓度的增加而增多。100μmol/L金雀异黄素处理后2 h,(±% vs ±%),然后逐渐下降。100μmol/L金雀