Westernblot实验步骤及注意事项（可修改）.doc

最新抗菌:..、(每克组织3mlRIPA),PMSF(每克组织30μl,10mg/mlPMSF),利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃(每克组织30μl,10mg/mlPMSF),℃约20,000g(约15,000转)-20℃(体积*蛋白质浓度),并加等体积的2×(浓缩胶20mA,分离胶35mA)(100mA40分钟),***凝胶中的蛋白质电泳转移到***纤维膜上。1)转移缓冲液洗涤凝胶和***纤维素膜,将***纤维素膜铺在凝胶上,用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。2)在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸(预先用转移缓冲液浸湿),将凝胶夹在中间,保持湿润和没有气泡。3)将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中,凝胶面向阴极。4)将上述装置放入缓冲液槽中,并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。5)按照厂家所示接通电源开始电泳转移。6)转移结束后,取出薄膜和凝胶,弃去凝胶。,直至分子量标准显现时取出,记录下标准位置。,必要时可用脱色缓冲液。℃保温1小时。,用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。,尽可能不留空气。,用透析袋夹紧。:NGS(100微升),印迹缓冲液中的抗体(10毫升),加在装薄膜的袋中,于室温下摇动2小时(或4℃过夜)-Tween缓冲液,分4次在一浅盘中洗涤薄膜,每次75ml。(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS)加在袋内,于室温下摇动1小时。。-HRP(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS),于室温下摇动。注意事项:westernblot中转移在膜上的蛋白处于变性状态,空间结构改变,因此那些识别空间表位的抗体不能用于westernblot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化,再用酶标记亲和素进行westernblot。实验中取胶和膜需带手套。Western,也称Westernblot、Westernblotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。(Proteinsamplepreparation)O可以使用适当的裂解液,例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献