qPCR实验从设计primer开始到计算方法详例.doc

本人在日本留学虽然对于具体的原理不是特别理解,现把详细的实验realtimePCR的实验方法写出来让大家来参考。第一步:primer设计Primerdesign:FindoutthemRNAofrelatedgene,forexample:Musmusculustransgelin(Tagln)SM22a,mRNANCBI>Nucleotide>GenBankopenthewebsiteofPrimer-ession,gi,orFASTANCBIReferenceSequnece:,anismthatyouuseformiceforhomosapiens,mice:Musmusculus(taxid:10090)Primerpair1Sequence(5'->3')TemplatestrandLengthStartStopTmGC%(reverseprimer)ontemplate 。提取mRNA对于组织,如血管。在冷的PBS液体中取出血管后马上放入液氮中。带全部样品提取完后,用粉碎机粉碎。大概20次/秒速度,10秒每次,3次。加入1mlTrizon,常温静止30min放于冰上,加入200ulchloroform,震荡混匀。13000rpm,4℃,离心10-15min取上清液,大概500-600ul加入500ul2-propronaol,震荡混匀,13000rpm,4℃,离心10-15min。(因小鼠组织太小,加入了4ul,precipitation)去掉液体,加入80%酒精500ul(一定要用无核酸酶的水,PCR用水),离心13000rpm,4℃,10-15min,重复操作2-3次。去液体,干燥,加入PCR用水,溶解mRNA测量RNA含量。定量RNA含量,保证样品中有650ng/ulRT-RCR5*buffer4uldNTP8ulRadomprimer1ulRTaceRPImRNA:6ul30℃,10min;42℃,60min;99℃,5min;4℃,∞完成后稀释样品5倍保存待用。18s做内参在保存用样品的基础上再稀释50倍。Real-timePCR每个样品做1次重复SYBRqPCRmix:ROX:PrimerF:PrimerR:DWcDNA:HOTstart:1min,95℃,1cycle;step:15s,95℃;45s,60℃,50cycle,Melt:30s,95℃。完成后,ROX做为reference,导出Ct值最后结果Ct值计算方式例子如:得到的值为samp