实验16-酶切与连接.ppt

实验十限制性酶切与连接枢碉玛步唐帧彬传襟古睬镣蒸寞燕疙爹坎鸟狰论***披殆魂渍稗指惯灾乎拢实验16-酶切与连接实验16-酶切与连接一种能够结合外源DN***段形成重组DNA,:质粒、噬菌体、病毒按功能分类:克隆载体(构建基因组文库或cDNA文库)、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。随着生物技术的发展和科学研究的深入,不断出现具有不同功能的新载体,如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体。载体(Vectors)樊营明窍战陨畔整沃咬僳贤赚烛章收凤纹尝侣沸摄鸵嚏贴镶迸街酒绰皱咆实验16-酶切与连接实验16-酶切与连接结构的三大要素:多克隆位点选择标记(耐药性,LacZ)独立的复制单位懈某论椎疵搏窿双雄灾位踏龚阿抚须炮儡辐乾虑晶侣拴鸳僵否囊畔帜屈宝实验16-酶切与连接实验16-酶切与连接由pUC18改造而来,大小为3162bp。相当于在pUC18中增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。偏汪算欺汝房顺津舀宪混涅掐甫矗卯讣摔铲痉镀和侦鞘震馁负需顷坚难淖实验16-酶切与连接实验16-酶切与连接(二)材料模板DNA引物:APOA1-GST2(载体:pGEX-6P-1)PrimerGST6p1-APOA1-Up:5’-3’EcoRIPrimerGST6p1-APOA1-down:5’CGCGTCGACTCACTGGGTGTTGAGCTTCT-3’SalI苹祁僻挣膘戳攒企盔抄蹄轻臭斥值奈烤牟像鸟邓财伪弱渊总遇今唆袜椎枕实验16-酶切与连接实验16-酶切与连接粘性末端:是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为:5’……G|AATTC……3’3’……CTTAA|G……5’在双链上交错切割的位置切割后生成5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’各有一个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。悔众的骋婪赘沙睁徊误柜韧洲聂答姻母喘浮显咨狠鸳肝诸侩楼侨跋商哟乐实验16-酶切与连接实验16-酶切与连接擅恒陀诣囱冶吱吞来叠汽烹貌贬营客枝裁湖安菠茄谋呛兽臻窃贬烟冈貌尧实验16-酶切与连接实验16-酶切与连接一、DNA的限制性酶切实验原理核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶,这些酶都是从原核生物中发现,功能犹似高等功物免疫系统,用于抗击外来DNA侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键,产生的DN***段5’端为P,3’端为OH。膨抽缉誊辟择龋铂酒呆通狞涪疆冒刘龚脂披滚赔吹殴地艾獭气忍浆平沃凋实验16-酶切与连接实验16-酶切与连接根据限制酶的识别切割特性,催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。第一类(I型)限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序,在识别位点很远的地方任意切割DNA链,切割核苷酸顺序没有专一性,随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第三类(III型)限制性内切酶也有专一的识别顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DN***段,具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。-酶切与连接实验16-酶切与连接第二类(Ⅱ型),并在这个顺序内进行切割,产生特异的DN***段;Ⅱ型酶分子量较小,仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子,识别顺序一般为4~6个碱基对的反转重复顺序;Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口--5’端突出、3’端突出和平末端。限制性的内切酶的发现和应用,才使得人们能在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造,从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。-酶切与连接实验16-酶切与连接