作业指导书文件编码:第1版第0次修改文件名称:耐药基因型检测操作规程作业指导书颁布日期2007年01月07日耐药基因型检测操作规程作业指导书目的本操作规程是关于使用in-house方法进行耐药性检测过程标准操作和结果分析保存的规程。适用范围适用于HIV-1耐药基因型测定。职责在使用in-house方法进行耐药性检测过程中,研究人员必须依照本标准操作规程进行操作。作业程序核酸提取:推荐使用QIAGEN公司QIAampÒViralRNAMiniKit提取RNA。:外侧上游引物MAW26:5’-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’;HXB22028-2050外侧下游引物RT21:5’-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3’;HXB23509-3539第二轮PCR:内侧上游引物PRO-1:5’-A-3’;HXB22147-2166内侧下游引物RT20:5’-AGTTCTAGCTCTGCTTC-3’;HXB23441-:PROS3:5’-A-3’RTAS:5’-CTCAGATTGGTTGCAC-3’RTBS:5’-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3’;HXB22946-2967反向测序引物:PROC1S:5’--3’RT20S3:5’-GTTCTAGCTCTGCTTC-3’参照国际标准株HXB2株(全基因1-9719bp)POL基因序列(2253-5096bp),其中蛋白酶(2253-2549bp),逆转录酶基因(2250-4229bp),整合酶基因(4230-5096bp)。,包括蛋白酶基因全长(1-99codon)和逆转录酶基因前300个氨基酸(1-300codon)。准备RT-PCR(逆转录及第一轮PCR)反应体系:在PCR准备间安全柜内进行,注意配置过程应在冰上进行。推荐使用TakaraOneStepRNAPCRKit(AMV),总体系25μl,见下表:反应数1410162410* ,待其溶化后震荡混匀5秒钟,短暂离心后置于冰上备用。,使用后立即放回-20℃保存。,管身标记清楚编号,置于冰上备用。-PCR反应体系(单位μl),按每管20μl将配制好的反应体系分装至PCR管中,注意将液体加至管底。RT-PCR(逆转录及第一轮PCR),分别将样本RNA、阳性对照样本RNA及阴性对照样本RNA各5μl加入相应PCR管中。注意不要发生交叉污染。,设定程序:50℃30分钟;94℃5分钟;94℃30秒,55℃30秒,72℃2分30秒,30cycles;72℃10分钟,4℃保温。运行程序。
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