《病毒学实验》2原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞）.ppt

实验二原代细胞培养(鸡胚成纤维细胞)一、细胞原代细胞:应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液,适当洗涤以后,加入营养液,通常即可使其贴附于玻璃瓶壁上,并生长增殖。继代细胞:将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。组织细胞培养传代细胞由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下,组织培养细胞中有时出现恶性变细胞,也就是癌变细胞,这种病变细胞具有很高的增殖势能,而且几乎可以无限地传代。1)胰酶(trypsin)来自牛或猪的胰脏,作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,使细胞分离。-%,37℃,。Ca2+、Mg2+和血清会降低其活力,所以细胞一旦分散后,可用血清培养基终止其消化作用。二、细胞分散剂2)EDTA•2Na(乙二***四乙酸二钠)是一种螯合剂,夺取组织中的Ca2+、Mg2+使其丧失完整性,从而使细胞分离。%(+%胰酶混合)。只用于传代细胞,不能用于原代细胞的消化。EDTA作用不受血清抑制,故消化后需彻底去除,否则影响细胞生长。3)胶原酶(collagenase)使细胞间质的脯氨酸多肽水解,从而使细胞分散。三、细胞培养的营养成分和培养条件基础培养基DMEM,MEM,Grace’setal.,生长液:含10%血清的DMEM培养液维持液:含5%血清的DMEM培养液其它的营养成分血清、抗生素等营养成分血清的作用提供细胞生存、生长和增生必须的调节因子补充基础培养液中没有或量不足的营养成分促进细胞贴壁中和毒性物质良好的缓冲系统;提供蛋白酶抑制剂血清的种类血清的处理无菌采集,过滤除菌。用前56℃灭活30min。1)细胞密度原代细胞:4-6×105个/ml传代细胞:2-3×105个/ml2)pH范围:-3)培养温度培养条件四、细胞的保存1、细胞培养物的常温短期保存1)实验室中细胞短期保存将已长成单层的细胞换液后置室温或20-22℃下避光保存,可达15天以上。将细胞培养温度由37℃降至32℃甚至30℃,可隔15-30天传代一次。2)长途运送细胞培养物的保存取刚刚长成单层的细胞培养物,弃去营养液,加入维持液至满瓶,勿使培养瓶内存留空气,随后用橡皮塞紧塞瓶口,并作适当的包扎。运输途中的温度应保持在15-25℃左右,到达目的地后,置37℃培养1天,再行传代。