实验十植物细胞骨架光学显微观察.ppt

十、植物细胞骨架光学显微观察内蒙古大学生技基地一、实验目的观察光学显微镜下细胞骨架的结构,了解显示植物细胞骨架的方法及其原理。二、实验原理细胞骨架是指在细胞中支持和连接细胞各组分,以及与细胞运动有关的结构,它包括微管、中间纤维、微丝。当用适当浓度的Triton X-100处理时,可将细胞内大部分蛋白质抽提掉,但细胞骨架系统的蛋白质却仍被保存,经过固定和考马斯亮蓝R250染色,从而在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。(一)器材:显微镜、50ml烧杯、滴管、容量瓶、载玻片、盖玻片、镊子。(二)试剂: :M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在M缓冲液中,其中咪唑是缓冲剂EGTA 和EDTA螯合 Ca离子,溶液并提供Mg离子,在低钙条件下,骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张,便于观察。配方:50mmol/L咪唑,50mmol/L kCl:, mmol/LMgCl2,lmmol/L EGTA(乙二醇双(a-氨基乙酸)醚四乙酸), EDTA,lmmol/L巯基乙醇或DTT(二硫苏糖醇)。三、 。 %Triton X-100,用M-缓冲液配。 %考马斯亮蓝R250,,冰乙酸7ml,。 %戊二醛,用6mmol/L磷酸缓冲液()配制。 %、7%、95%乙醇。 、正丁醇、二甲苯、树胶。(三)材料:洋葱鳞茎。磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液优缺点:?磷酸缓冲液的优点:(1)易配制各种浓度的缓冲液;(2)适用的pH值范围宽,可配置各种pH值的缓冲液;(3)pH受温度影响较小;(4)缓冲能力强,缓冲液被稀释后pH变化小。?磷酸缓冲液的缺点:(1)易与常见的钙离子Ca2+、Mg2+及一些重金属离子缔合形成沉淀;(2)会抑制某些生化反应过程,如抑制某些酶的催化过程等。考马斯亮蓝R-250考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合,尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色,并且在比较宽的范围内(15—20 g),扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。用考马斯亮蓝R-250后电泳图考马斯亮蓝R-250(固体)(一)取洋葱鳞茎内表皮细胞(约lcm2大小),使其下沉。 (二)吸去磷酸缓冲液,用1%Triton X-100处理20-30分钟。 (三)吸去Triton X-100,用M-缓冲液洗3次,,每次10分钟。. (四)3%-1小时(对照组开始处理)。 (五),每次10分钟。四、实验方法(六)%考马斯亮蓝R250染色20-30分钟。 (七)用蒸馏水洗1-2次,材料置于载玻片上,加盖玻片,即可镜检。 (八)如作永久制片,可使样品顺序通过如下试剂:50%乙醇,70%乙醇,95%乙醇,95%乙醇和叔丁醇混合液(1:1),每次5-10分钟,或正丁醇→正丁醇→二甲苯→二甲苯,每次5-10分钟。然后捞取样品,平展于载玻片上,中性树胶封固。