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Westernblot一、Westernblot历史及原理蛋白质印迹(Westernblotting)又称免疫印迹(immunoblotting),简称WB。1975年,继EdwinSouthern发明的“SouthernBlot”,eStark及其同事发明的“NorthernBlot”技术之后,受以上两个“转印”技术的启示,1981年“WesternBlot”这一技术正式问世。抗体技术的发展,电泳及转膜技术的改进使得WesternBlot操作日益简单;分析方法及工具多样化、成像技术的革新、高灵敏度示标信号的出现使得WesternBlot的检测范围得到扩展,定量/半定量成为可能。目前WesternBlot设备不断更新、技术不断发展,WB仍将在较长时间和应用领域内得到更加广泛的应用,其检测灵敏度也将不断提高。其基本原理与ELISA相似:通过PAGE(聚丙烯酰***凝胶电泳)分离混合蛋白质样品,转印到固相载体(例如***纤维素薄膜、尼龙膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。以转印到固相载体上的蛋白质(多肽)作为抗原,与对应的抗体(又称一抗)特异性结合,特异性抗体再与酶、荧光素或同位素标记的抗一抗抗体(又称二抗)起反应,经过底物显色或放射自显影以检测样品中特异性蛋白(见图1)。一抗的质量是WB成功的关键,现在市面上抗体公司很多,一般选择大公司大品牌的抗体对于实验的成功很有保证。但是由于实验经费的限制只能选择小公司或国产二线品牌的抗体,这个时候需要使用者尽可能多考究:①完整的质检数据;②售后承诺;③技术人员对产品的熟悉程度。对于二抗来说,选择就更需谨慎,虽然二抗看似简单,其质量却千差万别,对实验结果的影响也尤为重要。福因德科技(Frdbio)专注于免疫检测产品的开发和工艺研究,只做精品;如果客户购买的产品质量达不到标明的水平,无条件退货。对于WB的底物是根据二抗的标记酶来确定的,有大家较为熟悉的辣根过氧化物酶HRP(HorseradishPeroxidase,)和碱性磷酸酶AP(AlkalinePhosphatase),此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶(GlucoseOxidase)、β半乳糖苷酶β-Galactosidase,不同的酶对应的底物当然也不同,:样品制备总蛋白质的定量SDS-PAGE电泳转膜封闭一抗孵育二抗孵育加底物,显色/显影,定影/化学发光,下面将对这些步骤详细介绍。二、Westernblot操作流程在熟悉原理之后实验人员可以根据操作流程轻松开展实验,下面主要介绍关于Westernblot的主要操作流程。⒈样品制备:⑴动物细胞总蛋白的提取:细胞都含有一个保护细胞不受外界环境干扰的细胞质膜,细胞质膜主要由磷-脂双分子层组成。***的脂质形成的等离子体膜在具有亲水基团的同时也含有疏水性基团,从而自发的形成一个封闭的双分子层壁。膜蛋白嵌入在脂质双分子层,横跨疏水区,也就是说细胞膜主要由脂质和蛋白质组成,但其各成分的比例则是随细胞类型及生物种属的不同而对应变化。实验中提取细胞蛋白用到的裂解液中含有的表面活性剂如Triton-100、NP-40、SDS等,能够插入并破坏细胞膜的磷脂双分子层,从而达到细胞裂解的目的。这一类裂解液商品化的有很多,比如福因德科技研制的Western及IP细胞裂解液(Frdbio,)、RIPA裂解液(Frdbio,)、NP-40裂解液(Frdbio,)等。在蛋白提取过程中尽量冰上操作以防止蛋白降解,也可适量加入蛋白酶抑制剂PMSF,福因德科技(Frdbio)可提供效果较好的蛋白酶抑制剂(Frdbio,)。对于加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取:由于受药物的影响,一些细胞脱落下来,所以除收集贴壁细胞外还应收集培养液中的细胞。⑵细菌及植物组织总蛋白的提取:对于动物细胞来说质膜是其唯一的保护屏障,但是在植物细胞和细菌的质膜外还有一层坚硬的细胞壁存在。细菌的细胞壁主要由肽聚糖组成,由n-乙酰葡萄糖***和n-乙酰胞酸两种氨基糖经β-。而溶菌酶可以水解这一糖苷键从而达到裂解细胞的目的。对于细菌的裂解可以用含有一定浓度溶菌酶的PBS缓冲液(TE,)即可。而植物细胞壁主要由纤维素和果胶组成的,这为植物细胞赋予了细胞形状和刚度。对于植物组织蛋白的提取目前多用机械破坏法如液氮研磨或化学法如三***醋酸-***沉淀法或TCA***沉淀法;⑶对于需要提取特殊亚细胞结构的蛋白如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白、细胞膜蛋白等,由于操作比较麻烦,可以选用商业化的试剂盒,例如福因德科技(Fr