新型抗IgE人源化单克隆抗体的结构与功能研究.doc

新型抗IgE人源化单克隆抗体的结构与功能研究钱卫珠【摘要】:研究目的:I型超敏反应又称过敏反应,主要由特异性IgE抗体所介导,由于IgE处于变态反应炎症级联反应的最上游,在变态反应启动和发生过程中发挥着关键作用。1987年,首次提出应用抗IgE抗体治疗IgE介导的过敏性疾病,并描述了具有特异性结合能力的抗IgE单克隆抗体。1993年,Kolbinger等报道了一株鼠源性单抗(MaE11)的人源化过程,该抗体又称为Omalizumab或Xolair,包括大约5%的鼠源和95%的人源序列。6月,美国FDA批准Xolair上市。上市伊始,,显示出良好的市场前景。然而Xolair抗体与IgE的亲和常数则仅有26nM左右,当抗IgE抗体的治疗浓度达到IgE基础水平的100倍时,才可结合99%的IgE分子,从而充分抑制IgE分子与FcεR相结合。在过敏性哮喘患者体内,游离IgE水平可升高数倍,Xolair抗体的临床用量需要根据IgE的基础水平进行调整,往往需要数百毫克才能达到治疗效果。因此,Xolair的治疗费用十分昂贵,即使在美国也受到医疗保险的限制,当前仅用于吸入激素无法控制的严重病例。国外也有其它医药公司研制了抗IgE的人源化抗体(瑞士Novartis、美国Tanox公司),但由于其临床疗效尚不及Xolair,均于1996年终止了临床试验。本研究利用哺乳动物表示系统,制备了含有关键的功能表位的IgE片段(Fcε2-4),经过杂交瘤技术制备新型的高亲和力抗IgE单克隆抗体,筛选具有竞争抑制IgE与其受体FcεR结合功能的克隆。为降低鼠源单抗的免疫原性,对筛选获得的抗体进行人源化改造,比较制备所获抗体及Xolair与IgE结合的亲和力及体外功能,以期从结构上阐明该抗体的作用机制。经过该课题的研究,以期获得亲和力更高的、可望用于过敏性疾病预防和治疗的新型抗IgE人源化单克隆抗体。研究方法:本课题采用小鼠杂交瘤技术,利用IgEFcε2-4作为免疫原,免疫获得具有竞争抑制IgE与FcεR结合功能的鼠源单克隆抗体。为进一步降低单抗的免疫原性,减轻用于人体时的HAMA反应,提高安全性,我们采用计算机辅助设计模拟抗体空间构象的方法,对鼠源抗体进行了人源化改造,对改造成功的人源化单克隆抗体体外功能进行了详细分析,并与Omalizumab的体外功能进行比较。我们应用噬菌体随机七肽库对人源化单克隆抗体的抗原表位进行亲和淘选,从而明确抗体识别的表位,经过分析IgE与其高亲和力受体FcεRIα的复合物结晶,与抗IgE抗体所识别表位进行比较,从空间结构上解释和阐明抗IgE人源化单克隆抗体的功能学基础。结果:获得哺乳动物细胞表示的IgEFcε2-4以及FcεRIA,经过杂交瘤技术筛选获得具有竞争抑制IgE与FcεR结合的鼠源抗IgE单克隆抗体7A5。利用计算机辅助设计的手段,改造获得亲和力和特异性均较好的人源化抗IgE体Hu7A5m18。体外功能分析结果表明:Hu7A5m18可抑制IgE与可溶性及细胞表面FcεRI结合,而对结合于细胞表面FcεRI的IgE则无影响,Hu7A5m18能够抑制IgE与细胞表面FcεRI结合导致的脱颗粒反应。Hu7A5m18介导上述体外功能的EC50仅为Omalizumab的1/10左右。SPR技术检测M7A5、Hu7A5m1