大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代.doc

大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代.doc大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012-12-01—、试剂Poly-L-lysine(Sigma,P2636)DMEM(Invitrogen,H995-065)FBS(lnvitroge?10099-141)HBSS,noCalcium,noMagnesium(Invitrogen,14170-112)%Trypsin-EDTA(Invitrogen,25200-056)DPBS()ddH2O75%酒精二、器械手术器械:眼科剪x2、冃艮科镉直、弯各x2、显微镶x2(金钟,WA3050)、显微剪xl100ml小烧杯200目不锈钢筛细胞计数器(求精)50ml离心管(Corning,430828)、15ml离心管(Corning,430790)25ml培养瓶(Corning,430639)或75ml培养瓶(Corning,430641)100ml玻璃瓶(蜀牛)直径为60mm的培养皿(LabServ,310109010)3ml移液管(Biologix,30-0138A1)过滤器(Millex-GP,SLGP033RB)注射器:50ml、5ml各1Pipetteandpipettetips冰袋、手套、、枪头高温高压消毒15分钟,消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。。、移液枪,点燃酒精灯。,用DPBS将其稀释至100憾/ml。,量以覆盖培养瓶底面为宜。25ml培养瓶:3ml;75ml培养瓶:8mlo过夜。%FBSFBS:DMEM=1:10取FBS8mLDMEM80ml加入100ml高温高压过的玻璃瓶中。%%Trypsin-EDTA,用DPBS稀释2倍。将配置好的培养基、消化酶放入化冰箱中,待第二天使用。消毒操作台使用完毕后清理垃圾,用酒精棉球擦拭操作台、移液枪,关闭酒精灯,打开紫外线灯消毒30分钟。Day2消毒打开操作台紫外线灯消毒30分钟。洗板用ddH2O洗涤3x5minz放入培养箱中晾干。(所有操作在冰袋上进行)%,用酒精棉球擦拭操作台、移液枪,点燃酒精灯。,内乘HBSS,放置在冰袋上。,将头放入一个培养皿中。,取岀脑组织,将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中(将所有的新生鼠都同样处理)。,尽可能的去掉所有的血管和血管膜,将分离好的脑组织放入另一新的内乘HBSS的培养皿中。,约1mm3。。%胰酶,摇匀,37°C消化15分钟(为增加接触面积消化更充分可将离心管平放,也可以用60mm培养皿消化。)。,用移液管除去胰酶,每支离心管加入2ml10%FBS/DMEM终止消化。:用1ml枪头,吹打4