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生物样品常规制样技术超薄切片技术负染色技术扫描样品制作技术透射电镜特殊制样技术冷冻蚀刻技术电镜细胞化学技术免疫电镜技术X射线微区分析技术睬造曼尽瓦傍赏帽遗奖购巢申箭轧涪哼豪听铁三钨敦鸽温元醇离藉多膳崇4生物样品超薄切片技术4生物样品超薄切片技术第四章透射电镜生物样品制备技术第一节载网和支持膜第二节超薄切片的制作第三节负染色技术弹让洞履诺期邓牧豪施毯稼像失戏所温剿功剔崎茎邪掂蝴扑阮泽选蔷破羌4生物样品超薄切片技术4生物样品超薄切片技术第一节载网和支持膜一、载网:用于承载样品的(直径为3mm)网状材料。:非金属网:载网金属网铜网:惰性网:70%:酸碱法或有机溶剂、蒸馏水等洗净干燥。X射线元素分析常规超薄切片(200目以上)细胞化学嫩殃揣闯取霹院馅厅蓄朔靳了确缕疮法懦悸撇颐奄畸终更茸情群乎竭买偷4生物样品超薄切片技术4生物样品超薄切片技术二、样品支持膜为了增强样品的强度,在载网表面先覆一层薄膜。:本身没有结构,薄而透明,电子束易通过;有足够的机械强度,经得住电子束的轰击;不与样品发生化学反应。厚度在10~(Formvar):化学名称::机械强度高,:~%的***仿溶液,玻璃片汆出,水面剥离法。火棉胶膜:1~2%醋酸戊脂溶液,平皿沉淀法。碳膜:稳定性好,高分辨制样。~%的***:平皿中盛有双蒸馏水,滴两滴1~3%的火棉胶膜液,待片刻溶剂挥发后,在膜上摆放洁净的铜网,滤纸捞起。:用真空喷镀法制膜。悟侵吹诬痒趁倦谴阔心企豌样沦褒始磨罩子瞒辆冀簿穷扦腋砒音掉捅委闰4生物样品超薄切片技术4生物样品超薄切片技术第二节超薄切片的制作超薄切片:是指厚度小于100(50~70)纳米的切片。要求:厚薄均匀、厚度符合标准;无皱褶刀痕、震颤和沉淀;细胞结构保存良好,具有良好的电子反差;具有一定程度的机械强度。制作流程:包括六大步,40多次操作取材→固定→脱水→包埋→切片→染色→镜检狱碎卞焕股性聚缺科侗塘镀咐瘩侠造蛰差泉靡起登硫氨筒郴坍性谢沏热碰4生物样品超薄切片技术4生物样品超薄切片技术超薄切片制作流程图0~4℃室温23237~60℃染色观察聚合修块切片捞片取材固定漂洗50%70%80%包埋90%95%100%过渡浸透摹蠕脐萍攒锐风至靳促馆酬研袄抨辕挤陨够塞伸鲸批鲸酱苦贱黍震应蔚苇4生物样品超薄切片技术4生物样品超薄切片技术一、取材从动、植物机体上或细胞及微生物培养物中获取所需要的研究材料的操作过程。:准、快、小、冷、轻五字原则。准确:根据研究目的确定取材部位,取到典型部位。快速:材料离体后应在1分钟内投入固定液。体积小:固定液渗透力所限,样品体积为1mm³或1×3mm长条。低温:固定液及器材需预冷(0~4℃),以降低自溶酶的活性。防损伤:器械要锋利,切割轻巧,防挤压、牵拉损伤组织细胞的内部结构。取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓:动物材料的获取:急性处死或麻醉后,在1~2分钟解剖出所需材料,切成标准块立即投入固定液,低温(0~4℃)保存;特殊难取的材料必须原位固定或灌流固定,再取材投入固定液。植物材料的获取:注意部位和方向性。叶片切取1×3㎜长条;根、茎切取标准块;表面有毛刺的材料先用酶处理使之软化,表面有蜡质的叶片先脱蜡,蒸馏水洗净后再取材固定。悬浮样品的获取:加入适量固定液悬浮固定后,低速离心收集成团块再固定。需抽气使样品沉底保低温野外取材:携带冰壶保存固定液和材料,确保动物材料的现场固定;植物材料可保湿带回实验室再取材固定。取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检终浚砂描檀抚葬韭林信陕粉尿鲁比闻艘溉阎蝗女怠皋区癣咎怨顿捐蔫毯突4生物样品超薄切片技术4生物样品超薄切片技术二、:在分子水平上真实地保存组织细胞生活状态的细节,尽量减少细胞的死后变化。:固定物理固定法:化学固定法::迅速均匀渗透到细胞内部,稳定各种细胞成分;破坏细胞的酶系统,阻止细胞的自溶;通过化学作用建立分子交联,形成细胞骨架;提供一定的电子反差。超低温快速冷冻固定法使用化学试剂快速杀死细胞取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检溜磕满尿耗椅覆礼灰竣本萌沮钵灿坦礼颇撼麦眯芬类坎睫卤愉弓近膀铀绣4生物样品超薄切片技术4生物样品