实验八 利用琼脂糖凝胶分离DNA片段.ppt

实验八
利用琼脂糖凝胶分离DNA片段
【实验目的】
1、了解DNA片段回收纯化的基本方法和原理
2、通过本实验学习PCR产物纯化的原理与实验技术,为后续的连接反应和转化反应打下良好的基础。
【仪器与试剂】
仪器:琼脂糖凝胶电泳系统、紫外分析仪、离心机、水浴锅、单面刀片等
试剂: Gel Extraction Kit,50×TAE,Loading Buffer,琼脂糖,灭菌ddH2O等
【实验原理】
DNA纯化的主要目的是回收得到纯的目的DNA片段,去除影响DNA连接酶活性的物质以及其它的DNA片段。
纯化DNA片段的方法有多种,如:电洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接从 PCR产物中或琼脂糖凝胶中回收DNA片段的试剂盒,有效地加快了DNA的纯化的速度。
本实验采用了OMEGA公司的 Gel Extraction Kit试剂盒。该试剂盒采用了独特的凝胶融解系统,结合DNA制备膜技术,具有高效、快速、方便之特点,全套操作只需30分钟便可完成。回收纯化的DNA片段纯度高,完整性好,可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。
【实验步骤】
1、使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶,然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2、在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶,尽量减少凝胶体积,提高DNA回收率。并将切下的凝胶块装入提前称好空重(记作:W0)。
注:切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下,以防止DNA损伤。
3、称量含有胶块的离心管总重量(W1),得出凝胶块重量W2( =W1 - W0 ),并计算胶块体积。计算胶块体积时,以1mg=1μL 进行计算。
4、向胶块中加入等体积的Binding Buffer (XP2)。
5、55~60℃加热7min左右,中间间断混合(每2~3min),直到胶块完全融化。
注:胶块一定要充分融化,否则将会严重影响DNA的回收率。
6、将试剂盒中的HiBind DNA Column按置于2ml 的Collection Tube上。
7、 DNA Column中,10000×g离心1min,弃滤液。
8、将HiBind DNA Column置回2ml 的Collection Tube上,并向HiBind DNA Column中加入300μl的Binding Buffer (XP2),10000×g离心30~60sec,弃滤液。
9、将HiBind DNA Col