正确使用方法.doc

2004-5-261:18:00如何正确使用聚合酶链反应技术陶其敏如何正确使用聚合酶链反应技术陶其敏以紫外线照射反应体系,补骨脂素加合到核酸上,使加合了补骨脂素的DNA不能再作为模板,但仍能用于杂交。聚合酶链反应(polymerasechainreaction,简称PCR)又称体外酶促基因扩增。它以敏感,特异,快速的核酸分析技术而著称,是分子生物学技术的一项突破。由Mullis发明于1983年。经不断的改进,现今已发展出了不对称PCR(aeymmetri′cPCR),反向PCR(invereePCR),多重PCR(multipexPCR),锚定PCR(anchoredPCR),差异显示PCR(ololPCR),定量PCR(quantityPCR)等多种PCR技术。一、PCR的基本原理 PCR模拟于DNA的自然复制过程,引物按照碱基配对与DNA模板互补结合以后,在DNA多聚酶的作用下,按照碱基配对的原则(A、T,C、G),从引物开始合成与模板DNA互补的DNA链。经变性,退火,延伸等一次循环,DNA链数量增加一倍。二、PCR步骤的要点 :双链DNA模板在热作用下(一般在95℃),使氢链断裂,双链解离,形成单链DNA这一过程称之为变性。变性后的单链可以重新结合,形成双链,其他性质也同时复原。 :模板DNA经过变性,分解为两条单链。经过系统温度降低,引物退火与互补的DNA模板结合,形成局部的双链,这也是DNA复制的起点。 :引物与模板结合后,在DNA多聚酶的作用下,从引物的5′端向3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性,退火和延伸,DNA含量即增加一倍。三、影响因素 PCR的结果在上述每一个步骤中,均会受一些因素的影响。如: :C+G的核苷酸数应在45%~55%,以20个核苷酸为宜,如太短易出现错配,太长则易形成稳定的集合体。在一条引物内或一对引物间不应有5个以上的互补核苷酸。~,就可完成30~35个循环的扩增,。过高浓度可能导致异位引导,可出现非靶序列的扩增。 :在反应体系中不能含有高浓度的鳌合剂(如EDTA),及负电荷离子基团(PO-34)。Mg+2离子浓度要合适,它可影响引物的退火,模板和PCR中间产物的链解离,产物的特异性,引物二聚体的形成及酶活性等。Mg+2离子浓度也受DNA模板和鳌合剂的影响。 :无论市售国产或进口的,都是当前质量较好的酶。应以1~2U为宜,如加酶过量除浪费外,还有可能导致非靶序列扩增,太低又会影响PCR产量。但在经25~30次循环以后,酶含量便成为制约反应进行的因素。此时如仍需扩增,应以产物为模板,再行第二轮扩增为好。 :要以线性DNA作为模板最好。假如用质粒作反应模板,最好先将其线性化后再用。 :取决于反应体系中引物的浓度,引物长度及其核苷酸的组成,温度以比引物扩增的Tm值[(A+T)X2+(C+G)X4]低5°为宜。温度过低会增加引物与模板之间的错配现象,特异性就会下降。 :Taq酶的酶活性温度可在20℃~85℃之间。但温度太低会引起非特异性扩增现象的增加,太高则会引起引物与DNA之间的变性,因此一般选用72℃。延伸时