β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定.doc

β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定.docB半乳糖昔结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定作者:邱文洪吴丽娜叶许楚娟易路阳郭凯文【摘要】目的:构建B半乳糖昔结合凝集素9的真核表达载体并鉴定。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆B半乳糖甘结合凝集素9基因,(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果:(+)的多克隆位点。结论:成功构建B半乳糖昔结合凝集素9的真核表达载体pGal90【关键词】Gal9;构建;真核表达载体半乳糖凝集素家族(galectinfamily)成员参与了许多生理和病理过程,包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等U,2]。B半乳糖甘结合凝集素9(Gal9)是一种糖结合蛋白,属于半乳糖凝集素家族(galectinfamily)成员,组织分布广泛,在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等方面,发挥着重要作用[3]。目前对Gal9发挥作用的具体机制仍知之甚少,值得进一步深入探讨和研究,从而使Gal 9作为疾病治疗的新的靶点成为可能。为此,本研究拟通过构建表达人Gal9蛋白的真核表达载体,为进一步研究Gal9的作用机制打下基础。、限制性内切酶(MBI),Taq酶和RT试剂盒(Promega),RNA提取试剂盒(Invitrogen),质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒(Qiagen),DNAmarker(Tiangen),Trizol、1640培养基,人淋巴细胞分离液(天津溜洋生物制品科技有限责任公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),Galectin9引物(英骏生物技术有限公司)。()序列设计引物如下:上游引物:TCTACAA3',下游引物:P25,AC3,,下划线分别为Hindlll和EcoRI酶切位点,扩增Gal9的CDS序列,共1176bp。,加入肝素溶液(10~50u/ml血样本)抗凝,;吸取人淋巴细胞分离液置于刻度离心管中,加入稀释的全血;2000r/min离心20min;吸取所有单个核细胞,用Hanks液洗涤细胞3次。将单个核细胞离心收集备用。、(+)将离心收集的单个核细胞IX105加入Trizol1mL,混匀,室温5min;***仿,涡旋15s,4°C12000g,离心10min,,加入等体积预冷的异丙醇,放置10min,4°C12000g,离心10min,去上清液,加入1mL预冷的浓度为750mL/L乙醇,充分混匀振荡,4°C12000g,离心10min,去上清液,充分干燥,用50uL含1inL/LDEPC的ddlI20溶解沉淀,获得细胞总RNA。取5uL总RNA,按RTPCR试剂盒推荐方法以。ligo(dT)为引物合成cDNA第一链。取2H逆转录产物为模板,,10'PCR缓冲液5m,150mMMgS041m,1