细胞培养中的细节问题基础篇-,无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌,以70%ethanol擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转10分钟后,才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株,且即使培养基相同亦不共享培养基,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。,须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作,并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中,应避免引起aerosol之产生,小心毒性药品,例如DMSO及TPA等,并避免尖锐针头之伤害等。:、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)。,定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000小时/HEPA)。(Zephrin1:750),定期更换水槽的水。︰~,洗净后才开始使用。,以高压蒸汽灭菌,洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净,勿加清洁剂清洗。︰,高压蒸汽灭菌121℃,15lb,20分钟,置于oven中烘干。℃,4小时。%hypochloride溶液(次***酸,即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121℃,15lb,20分钟处理。基础篇-℃冰箱,避免光照,实验进行前放在37℃水槽中温热。(加血清)存放期为六个月,期间glutamine可能会分解,若细胞生长不佳,可以再添加适量glutamine。(以1升为例):%血清,因此粉末培养基之配制体积为900ml,-。NaHCO3为另外添加,若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差,或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合,然后用CO2气体调整pH,而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH),因为***离子对细胞生长可能有影响,且贮存时培养基的pH易发生改变。:纯水(milli-Q水或二次至三次蒸馏水,水品质非常重要),粉末培养基,NaHCO3,电磁搅拌器无菌血清瓶,,pH计,真空泵,CO2气体:-Q水中,搅拌使其溶解。-Q水中,搅拌使其溶解,然后通入CO2气体至饱和,约3-5分钟。。-,除非pH值偏差太大,否则不需用酸碱再调整之。若为太碱,可再通入CO2气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时,-。,同时分装至无菌容器中,标示培养基种类、日期、瓶号等,贮存于4℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤)。附-配制培养基之生长测试材料:MDCKcell(L-RC60004)6-wellTCplate(or35mmTCdish)methanolglacialaceticacid10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)步骤:,接种MDCK细胞于6-wellplate(或35mmTCdish)中,每个well接种1×102活细胞,同时作对照组实验。~7天后,在100倍倒立显微镜作观察细胞群落之
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