角膜缘干细胞体外培养的研究进展.doc

角膜缘干细胞体外培养的研究进展.doc角膜缘干细胞体外培养的研究进展[=【关键词】角膜缘;干细胞;体外培养;眼损伤角膜上皮细胞具有自我更新的能力,眼表的正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成。随着眼表疾病研究有突破性进展,角膜缘干细胞在眼表中的重要性越来越受到人们的重视,角膜缘干细胞体外培养的研究也日渐增多。笔者现就角膜缘干细胞的体外培养与临床应用作一综述。1概述角膜缘干细胞是角膜上皮增殖、分化、移行的源泉。角膜缘干细胞具有其他干细胞所具有的特殊的生物学特性,并通过向心性移动和角膜上皮基底细胞的分裂、迁移,来补充角膜表面脱落的上皮细胞,完成上皮细胞的更新这一•动态的平衡过程。目前认为角膜缘Vogt栅栏内的网状崎上皮是角膜上皮干细胞的位置所在。1971年Davanger等[1]提出角膜缘Vogt栅栏的概念并观察到此处细胞向角膜中心水平移动o1986年Schermer等[2]利用特异性64KD角蛋白(K3)的手段,正确定位角膜缘上皮干细胞的存在。1987年B^ato等[3]通过比较角膜不同部位细胞在体外培养的生长情况,也进一•步证实角膜上皮干细胞位于角膜缘处。角膜缘干细胞的确定和经过不断的探索研究,发现角膜缘干细胞具有以下特点[4]:①位于角膜缘基底部,%〜10%;②具有水平向心运动和垂直向上运动;③增殖力高,细胞周期长,分化程度低,不对称分裂;④不表达角蛋白K3;⑤含有丰富的蛋白酶:。■烯醇酶、细胞色素氧化酶、碳酸州•酶等;⑥角膜缘上皮细胞正常处于G1晚期,细胞富含周期蛋白A、D、E和增殖细胞核心抗原。2角膜缘干细胞的获取和分离角膜缘干细胞的正确定位,使获得干细胞作体外培养成为可能。,用1/1000络合碘消毒眼周,冲洗眼球后用手术刀从角膜缘切取组织块。尸体取材时•,在死亡后6h内取下眼球,剪取角膜缘内外各1mm角膜缘组织,去除多余结膜组织和基质层。用含双抗(105U/L青霉素加100mg/L链霉素)Hank液漂洗备用。、消化法及两种方法同时应用的混合法。将上述组织块剪成1mmX1mmX1mm大小,放入含少量纯胎牛血清培养瓶中密闭2h,缓慢加入少量培养基,37°C,5%CO2,95%湿度孵化箱过夜,次口补加培养基。接种后3天首次换液,以后隔口换液,每口倒置显微镜观察。此法操作环节少,细胞损伤小,可减少污染机会。但培养时间长,细胞成分复杂,常混有纤维细胞,分离和纯化较困难。,Hank液冲洗2次,/LED1A1:1混合为消化液,用量为组织量的30〜50倍,消化10〜15min到组织块疏松,弃去消化液。Hank液冲洗2次,消除ED1A消化作用,加入等量200mI/L胎牛血清的细胞培养液终止胰蛋白酶消化。吸出培养液后再加入新的培养液2次,消除残余消化作用。然后加入培养液进行吹打使细胞分散,1000r/,离心5min,取重悬细胞以100X106/L接种量移入有孔培养板进行培养。此法可在较短时间内获得细胞进行培养和研究,但操作复杂,对消化时间和温度的控制有较高的要求。。组织块消化后所得的细胞悬液移入培养器进行培养的同时,将组织块也一•起移入同