实验03革兰氏染色法.doc.doc

实验三革兰氏染色法 1 目的 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性. 学****掌握革兰氏染色技术,巩固学****光学显微镜油镜的使用方法。 2 原理革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 Christain Gram 氏创立的,革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌( G+ )和革兰氏阴性菌( G- )两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是:先用初染剂结晶紫进行初染,再用碘液媒染,然后用乙醇(或***) 脱色, 最后用复染剂( 如番红) 复染。经此方法染色后, 细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌; 如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色( 红色), 该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性, 是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上, 当用结晶紫初染后, 像简单染色法一样, 所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂, 它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物, 从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时, 两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成, 壁厚、类脂质含量低, 用乙醇( 或***) 脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小,透性降低,从而使结晶紫- 碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内, 经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同, 由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高, 所以当脱色处理时, 类脂质被乙醇( 或***) 溶解, 细胞壁透性增大,使结晶紫- 碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的红色。 3 材料 菌种大肠杆菌( Escherichia coli )约 24h 营养琼脂斜面菌种一支, 枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis ) 约 16h 牛肉膏琼脂斜面菌种一支。 染色剂结晶紫染色液、卢戈氏碘液、 95% 乙醇、石炭酸复红液。 仪器或其他用具显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。 4 流程涂片→干燥→固定→染色(初染→媒染→脱色→复染) →镜检。 5 步骤 涂片 常规涂片法取一洁净的载玻片,用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号,并在两端各滴一小滴蒸馏水, 以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片,干燥、固定。玻片要洁净无油,否则菌液涂不开。 “三区”涂片法在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水, 用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域, 并将少量菌液延伸至玻片的中央。再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域, 并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央,与枯草芽孢杆菌相混合含有两种菌的混合区,干燥、固定。要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色;涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性。 初染滴加结晶紫( 以刚好将菌膜覆盖为宜) 于两个玻片的涂面上,染色 1~ 2min ,倾去染色液,细水冲洗至洗出液为无色,将载玻片上水甩净。 媒染用卢戈氏碘液媒染约 l min ,水洗。 脱色用滤纸吸去玻片上的残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加 95% 的乙醇脱色, 直至流出的乙醇