Nrf2缺陷损害小鼠食管黏膜的屏障功能 PPT.ppt

Nrf2缺陷损害小鼠食管黏膜的屏障功能内容验证Nrf2参与食管黏膜的屏障功能,在抵抗胃食管反流病中发挥保护作用目的人食管样品获取、小鼠手术模型的建立;测定跨膜电阻;食管黏膜超微结构变化的镜检;食管黏膜ATP含量测定;基因芯片、免疫组化、Western杂交和染色质免疫共沉淀评价基因表达实验设计Nrf2缺陷通过破坏依赖能量的紧密连接而损害食管屏障功能结论2食管黏膜屏障功能黏膜屏障系统由3部分组成:上皮前屏障——包括表面黏液层(作用低到可以忽略),不移动水层和上皮细胞分泌的碳酸氢根离子;上皮屏障——包括多层磷状上皮细胞膜、细胞间连接复合物(紧密蛋白、糖蛋白机制和缓冲剂)、细胞内缓冲剂、和膜离子转运蛋白;上皮后屏障——包括血液流动和酸碱平衡3细胞质1(Nfe2L2,红细胞衍生核因子2样蛋白2)C家族,含有亮氨酸拉链结构(bZip结构),调节解毒和抗氧化应激相关酶的表达,是一种主要的细胞防御途径Nrf2蛋白Kelch样环氧***丙烷相关蛋白-1,一种与胞浆肌动蛋白结合的含624个氨基酸的多肽,是细胞氧化应激反应中的重要调控因子细胞核内重要的转录因子,可调节细胞内各种蛋白的表达、细胞分化和凋亡,同样含有bZip结构的。大Maf蛋白可以直接活化相应基因,小Maf蛋白必须与其他具有转录活性的bZip蛋白结合,形成异源二聚体促进基因转录,或自身形成同源二聚体抑制基因转录Keap1蛋白小Maf蛋白正常生理条件氧化应激或外源物质刺激细胞核ARENrf2信号通路在小鼠食管黏膜发育的成熟阶段被激活。在这个阶段,角质化的复层磷状上皮持续变厚,最后形成***的食管黏膜。由于角质化层是主要的抵抗物理应激和化学损伤的保护层,末端分化角质化细胞表达能够通过淬灭活性氧来提供保护作用的蛋白,故推测Nrf2可能参与食管黏膜屏障功能,可能在胃食管反流病中发挥保护作用。4实验设计人类食管活检样品采样人排除条件;10副正常人和非糜烂性胃食管反流病患者的活检组织样品;在胃镜检查期间从(食管)5cm近端到胃食管连接处获得的。动物手术模型的建立8周龄的野生型和Nrf2缺陷型C57BL/6J小鼠,每组5只。麻醉之后通过上中线切口进行吻合手术。食管胃吻合手术的目的是消除括约肌功能,允许自由的胃液反流,建立胃反流模型;食管胃十二指肠吻合术加胃切除术是为了获得十二指肠反流模型;食管胃十二指肠吻合术是为了获得混合反流模型。吻合手术之后,清洗腹腔,用6-0丝线缝合腹腔。5十二指肠食管胃吻合术:在食管远端和前胃处作3个越5mm切口,然后精确地黏膜对黏膜纵向缝合。食管胃十二指肠吻合术:在食管和十二指肠上作2个5mm切口,然后精确的黏膜对黏膜缝合。食管胃十二指肠吻合术加胃切除术:除了食管胃十二指肠吻合术,在胃食管连接处和幽门处结扎后切除胃部。6实验设计测跨膜电阻:食管黏膜组织浸入冰冷富氧的林格氏溶液,立即在迷你尤斯灌流室将黏膜一侧朝上固定住。平衡30min后,在2h内每15min,获取一次PD(电势差)、Isc(短路电流)和RT(总电阻)的基础电子读数。食管黏膜超微结构变化的镜检:每组处死上3只鼠,切开食管黏膜组织,用二甲胂酸缓冲液固定,之后用醋酸铀酰染色,以聚/床812树脂包裹,超薄切片机切厚薄两种切片,厚切片用甲苯***蓝硼砂染色后,光镜下为薄切片寻找适合镜检区域,薄切片固定在铜栅格上,用醋酸铀酰和雷诺柠檬酸铅进行双染,透射电子显微镜镜检。用显微生物学组件分析镜检照片上至少30个细胞的细胞间隙和电子致密物质密度。细胞间隙是测定两个相邻细胞细胞膜之间的区域。细胞间隙中的电子致密物质密度用除以细胞间隙得到的平均灰度值计算。用方差分析比较各组之间的差异。7实验设计RNA分离:每组处死3只鼠,切开食管黏膜,用RNA组织提取试剂盒提取总RNA,凝胶电泳测质量,分光光度计测浓度,生物分析仪测RNA完整性(RIN)。(RIN是RNA降解程度的指标,RNA的RIN必须在7以上才适合做芯片分析)基因表达谱分析:文中的芯片分析就是基因表达谱分析,目的是分析对照组和模型组食管黏膜组织中各种差异表达的基因和基因簇及其丰度。(基因表达谱是通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库,大规模cDNA测序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体组成,从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息。一般需要纯化mRNA做表达谱分析,本文没有说明有没有提纯mRNA)使用安捷伦双通道小鼠4×44微阵列芯片,通过北卡罗莱纳大学的芯片数据库进行数据预处理以进行质量过滤和数据标准化。获取的芯片数据映射的基因标记作为基因表达值。使用Excel进行组间(正常组和模型组)基因芯片显著性分析获取差异表达基因(假阳性平均数小于1)。基因簇分析(基因集合富集度分析)也是用Excel进行的。8大家有疑问的,可以询问和交