手足口病标本采集及检测技术方案.doc

手足口病标本采集及检测技术方案一、采集标本的种类、保存和运输(一)粪便标本。采集病人发病3日内的粪便标本,用于病原检测。粪便标本采集量5-8g/份,采集后立即放入无菌采便管内,外表贴上带有唯一识别号码的标签,4℃暂存12小时内送达实验室,-20℃以下低温冷冻保藏,需长期保存的标本存于-70℃冰箱。(二)咽拭子标本。采集病人发病3日内的咽拭子标本,用于病原检测。用专用采样棉签,适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位,应避免触及舌部;迅速将棉签放入装有3-5ml保存液(含5%牛血清维持液或生理盐水,推荐使用维持液)的15ml外螺旋盖采样管中,在靠近顶端处折断棉签杆,旋紧管盖并密封,以防干燥,外表贴上带有唯一识别号码的标签。4℃暂存并在12小时内送达实验室,-20℃以下低温冷冻保藏,需长期保存的标本存于-70℃冰箱。(三)血清标本。各省(区、市)在手足口病流行年份中均应采集EV71和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。采集急性期(发病0-7d)和恢复期(发病14-30d)双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化,评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。静脉采集3-5ml全血,置于真空无菌采血管中,自凝后,分离血清,将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中,外表贴上带有唯一识别号码的标签。将血清置于-20℃以下冰箱中冷冻保存。(四)疱疹液。在手足口病的实验室诊断中,从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因,可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒,然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液,迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液(含5%牛血清维持液或生理盐水,推荐使用维持液)的采样管中,在靠近顶端处折断棉签杆,旋紧管盖并密封,采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。所采集标本4℃暂存立即(12h内)送达实验室,-20℃以下低温冷冻保藏,需长期保存的标本存于-70℃冰箱。(五)肛拭子标本。采集病人发病3日内的肛拭子标本,用于病原检测。用专用采样棉签,从患儿肛门轻轻插入,适度用力弧型左右擦拭数下,拔出后,迅速将棉签放入装有3-5ml保存液(含5%牛血清细胞维持液)的15ml外螺旋的采样管中,采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。在靠近顶端处折断棉签杆,旋紧管盖,并密封,以防干燥。(六)尸检标本。采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本,每一采集部位分别使用单独的消毒器械。每种组织应多部位取材,每部位应取2-3份约5-10g的组织,淋巴结2个,分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中,采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。(七)脑脊液标本。出现神经系统症状的病例,可采集脑脊液标本,进行病毒分离或核酸检测。采集时间为出现神经系统症状后3天内,-。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中,4℃暂存立即(12h内)送达实验室,-20℃以下低温冷冻保藏,需长期保存的标本存于-70℃冰箱。但EV71感染神经系统时,很难在脑脊液中检测到EV71病原。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输,12小时内送达实验室。依照《人间传染的病原微生物名录》,肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装,置于冷藏保存盒内运输,尽量缩短运输时间。可采用陆路或航空等多种运输方式,但在运输过程中应采取保护措施,避免强烈震动、重力挤压等现象。在送到省、地、市级CDC实验室时,包装盒内应带冰且包装完整。在上送标本的同时,需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》。二、标本采集注意事项在手足口病的实验室诊断中,从疱疹液或脑脊液中分离到病毒即可诊断该病毒为病因。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中,如含5%牛血清维持液。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。为了保证检测结果的准确性和有效性,标本应在病例发病后尽早采集,尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断,急性期血清应该在发病后尽早采集,恢复期血清在发病两周后采集。标本保存液的配置见下表:保存液Eagle`s液(MEM)%L-谷氨酰***%、链霉素(各10000U/ml)10ml三、实验室检测操作流程(一)病毒分离。(1)细胞的生长液、维持液的配制见下表:生长液(GM)维持液(MM)Eagle`s液(MEM)%L-谷氨酰***%、链霉素(各10000U/ml)(2),终浓度为青霉素