生物化学实验六 蛋白质的酸水解及其氨基酸的纸层析鉴定.doc

生物化学实验六 蛋白质的酸水解及其氨基酸的纸层析鉴定.doc生物化学实验六蛋白质的酸水解及其氨基酸的纸层析鉴定实验六蛋白质的酸水解及其氨基酸的纸层析鉴定一、目的要求学****和掌握蛋白质的水解方法以及纸层析法分离氨基酸的基本原理和方法。二、实验原理蛋白质可用酸、碱或酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、铉肽酶、段肽酶、二肽酶等)水解,其最终产物为氨基酸。碱法水解产生的氨基酸要发生外消旋化,;酶法水解需要多种酶的联合作用,。最常见的是酸法水解,其优点是在水解过程中不发生外消旋作用,。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的,但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸法水解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物呈棕黑色,因此,用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。展层剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置由迁移率(Rf)来表示:Rf=点样点到溶剂前沿的距离在一定的条件下,某种物质的Rf是常数。Rf的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量与层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法来分离蛋白质酸水解液中的氨基酸。三、材料、器材与试剂1>材料酵母粉。2〉器材安甑瓶、干燥箱、蒸发皿、沸水浴、试管、烧杯、铅笔、尺子、层析缸、层析滤纸、、毛细管、喷雾剂。3>试剂6mol/L盐酸。10%的异丙醇。展层剂(4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物):将20ml正丁醇和5ml冰醋酸放入分液漏斗中,与15ml水混合,充分振荡,静置后分层,放出下层水层即可。标准氨基酸溶液:%的赖氨酸、脯氨酸、缀氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(%)各5mL显色剂:%水合年三***•正丁醇溶液。四、实验步骤(1)蛋白质的酸水解:,装入一个安甑瓶中。向瓶中加入lml6mol/L的盐酸,于火焰上封门。再将安甑瓶放干燥箱内,在110^120°C下水解24h。然后把安甑瓶内的水解液倒进蒸发皿内,放入沸水浴上加热以出去盐酸。再向蒸发皿内加入少量蒸馅水溶解残留物,继续在沸水浴上加热除去水分。当水解液的pH接近3时,将水解液再次蒸干后,-%的异丙醇中备用。⑵取层析滤纸(22cmX14cm)—张。在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔画一条直线,。在点样点下用铅笔标明试样简称。(3) 点样:用毛细管将各标准氨基酸样、混