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最新五制碱性磷酸酶的动力学分析.ppt


文档分类:医学/心理学 | 页数:约17页 举报非法文档有奖
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碱性磷酸酶碱性磷酸酶的动力学分析的动力学分析?酶促反应动力学: 研究各种因素对酶促反应速率的影响,并加以定量的阐述。?影响因素包括: 酶浓度、底物浓度、 pH 、温度、抑制剂、激活剂等。碱性磷酸酶碱性磷酸酶米氏常数的测定米氏常数的测定原理原理??米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的常数,通过实验,可理解并掌握利重要的常数,通过实验,可理解并掌握利用实验求出用实验求出 Km Km 的方法。的方法。?在酶促反应中,当反应体系的温度、 pH 及酶浓度恒定时, 底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系。?米氏方程式: 反应速率与底物浓度关系的数学方程式。[S] :底物浓度 V:不同[S] 时的反应速率 V max :最大反应速率(maximum velocity) K m:米氏常数( Michaelis constant) V V max [S ] K m + [S] = ── V V max max V V [S] [S] K K m mV V max max /2 /2 Km 值等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度,单位是 mol/L 。酶底物复合物 E + S E + P ES ( (过渡态过渡态) )V V max max [S [S ] ] K K m m +[S] +[S] V = V = (林-贝氏方程) + + 1/V= 1/V= K K m mV V max max 1/V 1/V max max 1/[S] 1/[S] 两边同取倒数两边同取倒数双倒数作图法-1/ K m 1/V 1/V max max 1/[S] 1/[S] 1/V 1/V ??本实验以碱性磷酸酶( 本实验以碱性磷酸酶( AKP AKP )为材料,用磷)为材料,用磷酸苯二钠为其底物。酸苯二钠为其底物。?? AKP AKP 催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与盐。酚在碱性溶液中与 4 4一氨基安替比林作用, 一氨基安替比林作用, 经铁***化钾氧化,可生成经铁***化钾氧化,可生成红色的醌衍生物。红色的醌衍生物。??根据红色的深浅可测出酚的含量,进而算出根据红色的深浅可测出酚的含量,进而算出相应的酶活性相应的酶活性(V) (V) 。。??再根据再根据 Lineweaver Lineweaver —— Burk Burk 法作图,计算法作图,计算其其 Km Km 值。值。操作操作??底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响?? 1) 1) 取试管取试管 8 8支,按下表操作支,按下表操作( (应特别注意准确吸取底物溶应特别注意准确吸取底物溶液及酶液液及酶液) ): : ??加入酶液立即计时,混匀后置加入酶液立即计时,混匀后置 37 37 ℃℃水浴准确保温水浴准确保温 15min 15min 。。?? 2) 2) 保温结束,各管立即加入碱性溶液保温结束,各管立即加入碱性溶液 1ml 1ml 以终止反应以终止反应。。?? 3) 3) 各管中分别加入各管中分别加入 4- 4- 氨基安替比林溶液氨基安替比林溶液 1ml 1ml 及及 %铁%铁***化钾***化钾 2ml 2ml ,混匀,放置,混匀,放置 l0min l0min ,以第,以第 8 8管调零点,于管调零点,于 510nm 510nm 波长处比色,测定各管吸光度。波长处比色,测定各管吸光度。酶促反应速度计算酶促反应速度计算??酶促反应速度以每酶促反应速度以每 15 15 分钟所产生酚的微克分钟所产生酚的微克数数( (μμg g/ / 15min) 15min) 来表示。来表示。??根据酚标准曲线查出各管的酚含量,即各根据酚标准曲线查出各管的酚含量,即各管在不同底物浓度下的反应速度。管在不同底物浓度下的反应速度。??本实验不制作酚标准曲线,而以本实验不制作酚标准曲线,而以 1 1/ / [S] [S] 对对 1 1/ /A A作图,因各管吸光度与其酚含量成正作图,因各管吸光度与其酚含量成正比,故比,故可用吸光度代表酶促反应速度。可用吸光度代表酶促反应速度。

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