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下一代测序技术.doc下一代测序技术摘要:DNA测序技术对生物学的发展右着最根本的意义。Sanger法测序经过了30年的应用和发展,而在过去三年中,以454,solcxa,SOLiD为代表的高通量测序平台已经大幅度降低了测序成本,提高了测序速度,成为基因组测序市场的主流。•在此基础上,各种下一代测序技术正在快速研发,将使基因组测序和重测序的通舄和成本更加平民化,为基因组学、遗传学、生物医学和健康科学等领域的发展创造更加广阔的前景。本文将对所有新的测序技术的原理、优势和应用进行总结和展望。1977年Maxim、Gilbert发明的化学降解法测序技术和Sanger发明的双脱氧末端终止法测序技术不仅为他们赢得了诺贝尔奖,也使得从DNA序列层面研究分子遗传学成为可能。特别是后者,从最开始的凝胶电泳到越来越高通量的毛细管电泳,从开始的手工操作到越来越多自动测序仪的出现,各种改进的Sanger测序技术统治了DNA测序领域三十年,至今仍在长片段测序,大片段文库测序方面有广泛的应用。人类基因组计划(HGP)的完成就是靠Sanger测序法。在耗费了庞大成本的人类基因组计划宣布完成之后,越来越多的^■■测序工作对测序成本和通量提出了更高的要求,新一代测序技术(也被称为第二代测序技术)开始登上历史舞台。2005年454lifescience公司率先推出了焦磷酸测序技术,使测序成本较Sanger法降低了100fg,速度■■■100倍,人类基因组测序逐步进入了100,000美元时代。如今,454FLX测序仪(RocheAppliedScience)>基于“边合成边测序”的Solexa测序仪(IlluminaInc.)和的SOLiD测序仪(AppliedBiosystems)已经成为基因组测序市场的主流机型。除此之外,2008年一年内又有HcliScopc单分子测序仪(Hclicos)和Polonator(Dover/Harvard)两种测序机型商品化。在NHGRI(美国人类基因组研究中心)的支持和推动下,未来儿年内测序成本将在目前基础上再下降100倍,最终使个人基因组测序成本降至1000美元,人类将革命性的进入个人基因组时代。高通量和低成本的测序技术将进入到普通实验室,基因组测序的简单化将使分子生物学飞跃发展,个人基因组测序产业化也将对健康医学等领域产生革命性的影响。本文将首先对目前已经商品化的新一代测序技术(454、Solexa、SOLiD、HeliScope)做一介绍和比较,再对正在研发中的各种下一代测序方法(第三代测序技术)的原理和应用做■详细的介绍和展望。Roche454测序技术2005年454生命科学公司在《自然》杂志发表论文,介绍了一种区别于传统Sanger法的全新高通量测序方法,将测序成本降低了100倍以上,开创了第二代测序技术的先河,454测序仪也成为最先商品化的第二代测序仪。正是在此基础上,。454测序技术的原理在于首先使用乳液PCR(emulsionPCR)技术(图一a)扩增已经连接上接头的基因组文库片段,扩增子结合在28pm的磁珠表面,将乳液破坏后用变性剂处理磁珠,再将含有扩增子的磁珠富集到芯片表面,用测序引物进行测序。在测序过程中,454使用了一种“焦磷酸测序技术”(cing),即在合成DNA互补链的过程中,每加入一种单