CDK2、CyclinE2和EGFP的融合表达载体的构建及表达.pdf

内蒙古医学院
硕士学位论文
CDK2、CyclinE2和EGFP的融合表达载体的构建及表达
姓名:刘新凤
申请学位级别:硕士
专业:免疫学
指导教师:关泽红
20100501
中文摘要目的克隆小鼠的基因和基因,构建融合表达、和增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体狢蚿—,并确定其在真核细胞中的表达情况,为进一步在体内研究对减数分裂过程的亚细胞定位及作用机制奠定基础。方法从小鼠睾丸组织中提取总τ肦狿技术扩增基因和基因,分别将两个基因连接克隆到籘载体,经限制性内切酶酶切鉴定正确后测序。测序正确后,亚克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体狽希菇╬—和猚真核表达载体,单双酶切鉴定。将重组载体及空载体狽弥侍遄H镜姆椒ǖ既松窖胎儿成纤维细胞中,观察小时后绿色荧光的表达情况。并用筛选埽陨秆阳性克隆。结果测序证明克隆的和序列正确,酶切鉴定证实中目的基因片段和载体笮。较蚝筒迦胛坏憔贰转染山羊胎儿成纤维细胞后观察到绿色荧光蛋白表达秆〉椒⒐庀赴寺=论晒寺⌒∈蟮腃蚝蚦基因;晒菇╬—和融合表达载体;刈樵靥遄H菊婧讼赴蟊ǜ婊虻谋泶铮徊街っ重组载体构建成功;迷靥宓某晒菇ǹ梢晕=徊皆谔迥谘芯緾虲在减数分裂中的蛋白定位及探讨对减数分裂的作用机理奠定实验基础。关键词周期蛋白依赖性激酶细胞周期蛋白融合蛋白基因克隆基因表达和猚—~
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、和的融合表达载体的构建及表达位研究【拔縪因此我们选用作为分子标签,试图通过构建与的融合表达载体来确定在生殖细胞中的定位信息及作用机理细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶一—珻是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶可由细胞周期蛋白せ頾被化后可使蛋白磷酸化,解除了其对转录因子囊种谱饔么佣舳疍的合成并促进谙喙鼗虻淖B肌窍赴ü鼼疭期检验点进入诘墓丶6跏至过程中由于没有冢衔狢约跏至训淖饔貌淮蟠盝】闎等敲除小鼠基因后出乎意料地发现小鼠胚胎发生、生长发育等一切正常,只是雄性不育,精子发生过程中的减数分裂受到影响】源薈爰跏至压叵档难芯勘甘芄注‘。目前关于在减数分裂中作用的研究还在起步和功能研究阶段。关于在减数分裂机理方面的研究比较少见。等町研究发现减数分裂与有丝分裂不同,在进行减数分裂过程中的位于染色体上菼研究发现在减数分裂前期南赶咂诘剿咂冢珻隡黄鸲ㄎ挥谌旧宓亩肆8浇R虼宋颐侨为在减数分裂中的亚细胞定位研究可能是揭示在减数分裂中作用机理研究的第一步。绿色荧光蛋白珿且恢掷醋运傅纳锓⒐馕镏剩紫外光激发下可发出绿色荧光【銮啃吐躺ü獾鞍,蚴窃贕的基础上经碱基修饰和人源化改造而来的,是比ü馇度更强的一种Ш煲啤蓖槐涮澹诒A鬐原有特点的基础上,其荧光强度为倍珽肿恿拷蟙庇胪庠椿蛉诤媳泶锸保珽话悴挥跋外源蛋白的构象和功能,且无细胞毒性,可在活细胞内长期表达,外源蛋白质在细胞内的表达、迁移及定位情况可由产生的荧光来反映。是一种理想的生物分子标签,目前已被用于多种不同融合表达载体的构建及蛋白在不同细胞器内的定本研究中我们克隆小鼠的和基因,首先与籘载体连接并测序,证明所得到的目的基因序列正确,再将目的基因亚克隆到携带有绿色荧光蛋白基因的狽靥迳希直鸸菇╬—和猚融合表达载体,通。.
后立即用处理过的剪刀和镊子将其睾丸取出,投入液氮中,将冰冻后的睾丸组织内鐾直匡堂瞳亟土婴塞生堂鱼途塞过脂质体法将重组质粒转染山羊胎儿成纤维细胞,观察绿色荧光蛋白的表达情况,从而证明融合表达载体构建成功与否。⒅柿:途实验室保存的内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞系,此细胞的培养用/胞培养液,加入%的胎牛血清和/那嗝顾兀斗痬牧疵顾。培养条件:℃,饱和湿度,菌种甤蚿—载体均由本实验室保存,.镒橹小鼠为周龄的雄性昆明小鼠,购自内蒙古大学实验动物中心。小鼠脱臼处死存放于一%、琼脂糖凝胶厥帐约梁泄鹤訟荆籖一靥濉、各种限制性内切酶、及购自大连公司;疐一、购自磺嗝顾亍⒘疵顾亍⒈曜继ヅQG濉鹤許公司;其它常规生化试剂均为国产分析纯。主要仪器设备型德国电泳仪偷缬疽北京市六一仪器厂一℃超低温冰箱海尔嗟超净工作台—一ト说ッ婢换ぷ魈苏州离心机美国凝胶成像仪凝胶成像系统⒐。粥、狟—
:,/为S肙凼苤直匡堂瞳亟±〖胺醋B按樘崾约梁兴得魇榈牟僮鞣椒ㄌ崛∽躌,具体操作步骤如下:骱靡淮涡钥谡帧⒚弊雍拖鸾菏痔祝寐确旅耷虿潦貌僮魈妫右冰箱中取出冻存的小鼠睾丸组织放人预冷的水处理过的研钵,倒入少量液氮,迅速研磨至粉末状;蜓胁诜执渭尤胧柿縍苍,将粉末全部覆盖,加速研磨直至匀浆变为无颗粒透明状液体;冉R