第四章 细胞培养研究技术.ppt

基本操作技术和要求由于体外培养的细胞没有抗感染能力,因此防污染是决定培养成功的首要条件。一切操作需要保证无菌和有条不紊。培养室内的无菌技术培养前的准备:按实验计划和程序准备物品,作到心中有数。培养室和超净台:定期全面彻底消毒洗手和着装:均按外科手术要求实验中无菌培养操作:均在火焰近处进行,实验用品需火焰灭菌,冷却后接触培养细胞,以防烧死细胞。培养细胞的取材基本要求:取材组织用培养液浸泡,4度运送,24h内尽快培养。取材无菌操作,避免对组织的机械损伤,尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织,污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同时保留组织学和电镜标本,对供体来源、部位及一般情况做记录。皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要来源。取材方法似断层皮片手术,面积2-。因分布在体表,故细菌、霉菌很多,需严格消毒,可用较高浓度抗菌素漂洗。内脏和实体瘤的取材内脏除消化道和泌尿管道外基本是无菌的,明确取材部位,去除结缔组织。肿瘤组织取材避免坏死液化和结缔组织,标本应按污染组织处理。血细胞的取材血细胞培养可用于造血干细胞移植、免疫活性细胞的治疗和染色体分析等。取血抗凝剂量过大易导致溶血,肝素常用浓度为20U/ml,针管用较高浓度肝素500U/ml湿润。鼠胚组织的取材无菌消毒方法小鼠置于75%酒精的烧杯中5分钟固定于消毒的小木板上剪开皮肤解剖取材取材的组织放置于平皿内培养组织材料的分离欲从组织中获得大量生长良好的细胞,须将组织分散开,使细胞解离出来。常用方法有机械法和化学法。细胞悬液的分离方法离心法:血液和体液等细胞悬液500-1000rpm转速5-10分钟。离心速度过大、时间过长,会造成细胞损伤和死亡。密度梯度离心法:用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中,再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的的细胞。常用介质有Ficoll400,Percoll,泛影葡***等。。