生化大实验实验报告..doc

生化大实验实验报告姓名: 学号: 专业: 班级: 实验班级: 单位: 指导老师: 实验 1 多酚氧化酶( PPO )的分离提取一、实验原理: 多酚氧化酶(PPO) 能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌,它是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶, 位于质体、微体内, 可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节,属于末端氧化酶的一种。植物受到机械损伤和病菌侵染后, PPO 催化酚与 O 2 氧化形成为醌,使组织形成褐变, 以便损伤恢复, 防止或减少感染, 提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用, 所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外,多酚氧化酶也可以与细胞内其他底物氧化相偶联, 起到末端氧化酶的作用。蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同, 通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将 PPO 蛋白从体系中析出, 且大分子蛋白质不能通过透析膜。二、实验目的: 通过本项实验, 学****和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法, 掌握相关的仪器设备的正确使用的方法,以及蛋白质的提取分离的系统技术。三、材料与试剂: 1. 材料:马铃薯(两小组共称 200g ) 2. 试剂: 磷酸缓冲液 pH (内含 巯基乙醇, EDTA , 5% 甘油, 1% 的聚乙烯吡咯烷***)配制是配 x10 倍的浓缩液 1000ml ; 固体硫酸铵; 磷酸缓冲液 pH (内含 巯基乙醇, EDTA , MgCl 2) 3. 设备: 试管与试管架; 烧杯、玻璃棒; 移液管、滴管等; 试剂瓶; 透析袋; 过滤纱布; 植物组织匀浆机; pH 计和 pH 试纸;高速冷冻离心机; 四、操作步骤: 1. 两小组共称取 200g 土豆削皮后切成小块,加入 3 00ml 缓冲液 A ,两者按 1:1(W/V) 比例匀浆 1min ; 2. 用两层纱布将所得的浆液过滤; 3. 将匀浆滤液装入 2 00ml 的离心管 10000rpm 离心 5min ; 4. 上清液两组平分, 每组 150ml ,加 5g 硫酸铵固体搅拌均匀后 10000rpm 离心 5 min ; 5. 取上清液定容至 150ml ,加入 硫酸铵固体搅拌均匀后 10000rpm 离心 8 min ,倒掉上清液得粗酶沉淀, 用并加入 10ml 磷酸缓冲液 B 复溶沉淀 3-5min ; 6. 将所得溶液倒入透析袋中,用 的 KCl 溶液透析至无硫酸铵根离子。五、结果和分析: 实验所得的初酶液颜色为浅黄色, 颜色浅, 主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少,从而最大程度的保留了 PPO 的活性;经过一个夜晚的透析,得到了澄清的略带黄色的液体,这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。六、讨论与结论: 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速,防止酚类充分暴露在空气中被氧化; 2 .实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净; 3. 加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢, 同时伴有玻璃般的搅拌, 在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大, 使蛋白变性, 并注意用量的计算, 第二步加入的时候起点浓度是 40% 而不是 0 ,否则会加入过量,影响实验的结果; 4. 透析时,提前检查透析袋是否完整,避免透析时出现孔洞导致样品丢失。实验 2 胰酶分离提取及活性诱导一、实验原理: 胰酶是医药、食品、饲料等工业上重要的酶制剂, 胰酶的分离提取是普通生化实验的最主要、最经典的实验。提取胰酶的经典方法,多采用硫酸铵分级沉淀,胰酶在 75% 饱和硫酸铵中沉淀,其它杂蛋白一般在 10% 硫酸铵饱和度下被沉淀除去。经此多次提取,最后在 pH 硼酸缓冲液中得到结晶。胰酶在 pH 时最为稳定,可在低温下储存较长时间而不失活;低于此 pH 酶易变性; 高于 pH 时, 酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程易在低 pH 和低温下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。二、实验目的: 本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验, 掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备样品。三、材料与试剂: 1. 仪器:紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、 pH 计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盘、乳钵,大玻璃漏斗、抽滤瓶,塑料小桶、纱布、 pH 试纸,滤纸、玻璃器皿等; 2. 材料:新鲜猪胰脏; 3. 试剂及溶液配制: pH 乙酸酸化水、 H 2 SO 4 溶液、 2M NaOH 溶液、 5M NaO H 溶液、 HCl 溶液、 HC1 溶液、