酸性磷酸酯酶性质的探究及其固定化..docx

酸性磷酸酯酶性质的探究及其固定化中国海洋大学海洋生命学院 2011 级生物化学与分子生物学摘要: 以紫贻贝消化腺为原料提取一种酸性磷酸酯酶(acid phosphatase ,编号: EC ) , 进一步将原酶液盐析、透析、层析纯化,经 SDS-PAGE 电泳得到酶带。该酶水解对磷酸苯二钠最适 pH 值为 4 ,最适温度为 35℃, K+、 Mg+ 、 Na+ 、 Ca+ 四种金属离子都能促进酶活,其中, Ca+ 的促进作用较小。对该酶用两种方法固定化,活性炭吸附和海藻酸钠包埋, 其中活性炭吸附后的酶最适温度基本保持不变, 而海藻酸钠包埋后的酶最适温度有较大改变。关键词:紫贻贝酸性磷酸酯酶性质固定化酸性磷酸酯酶酸性磷酸酯酶(acid phosphatase , 编号: EC ) 属于Ⅱ型非特异性磷酸单酯酶, 酸性磷酸酶广泛存在于生物界,从低等生物大肠杆菌, 酵母到高等动植物组织,体液以及人类肝脏、前列腺等都发现有酸性磷酸酯酶的存在。它与物质代谢关系密切, 通过催化磷蛋白的水解, 在细胞调节过程中起着重要的作用。本研究可以确定该酶的最适催化条件,并探究其固定化方法,对其发挥催化功能并大量生产应用具有一定的作用。 1. 酸性磷酸酯酶的提取酸性磷酸酯酶( Acid Phosphatase , ACP ) 存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中, 能专一水解磷酸单酯键。本课题选用紫贻贝消化腺中的酸性磷酸酯酶为材料, 将买来的紫贻贝用过滤的海水饥饿处理 4~8 小时。戴上手套, 将紫贻贝解剖后, 观察其消化腺的位置, 取下腺体与其周围组织, 取紫贻贝消化腺, 用滤纸吸干后称重 , 加入 1 倍体积预冷的缓冲液和石英砂在搅拌机中完全研成浆状。静置 。继续 4℃,4000rpm/min ,离心 10 分钟。将离心管中大部分上清液倒入量筒中, 少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤, 一并收入量筒中以测量体积 114ml ,然后倒入三角烧瓶中,做好标记,用塑料薄膜密闭,作为“原酶液”。计算粗酶液得率( mL/g ) (粗酶液得率=上清液体积/ 紫贻贝消化腺的重量) 为 % 。将原酶液精确三等分,一份进行梯度盐析提纯;一份放于冰箱内保存,用来做凝胶过滤层析(实验六) ;一份用于酶固定化实验。 2. 标准曲线的绘制酸性磷酸酯酶( Acid Phosphatase , ACP ) 存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中, 能专一水解磷酸单酯键。本课题选用紫贻贝消化腺中的酸性磷酸酯酶为材料, 磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用, 水解后生成酚和无机磷, 其反应式如下: 由上式可见, 当有足量的底物磷酸苯二钠存在时, 酸性磷酸酯酶的活力越大, 所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义, 在酶促反应的最适条件下每分钟生成 1 微摩尔(μ mol ) 产物所需要的酶量为一个活力单位,因此可用 Folin- 酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。本实验所采用的是 Folin- 酚法。蛋白质含有两个以上的肽键(— CO — NH —) ,因此有双缩脲反应,在碱性溶液中,能与 Cu2+ 形成络合物。 Folin 酚反应是在双缩脲反应的基础上, 引进 Folin 试