大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经元样细胞两种方法比较的实验研究.pfg.pdf.pdf

中文摘要大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经元样细胞两种方法比较的实验研究摘要目的:骨髓基质细胞(marrow stromalcells,MSCs)是存在于骨髓中除造血干细胞之外的另外一种干细胞,它不仅具有强大的增殖能力,在体外扩增可获得大量子代细胞,同时具有多向分化潜能,在一定条件下不仅可分化为中胚层起源的细胞,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等,还可分化为外胚层起源的神经细胞,更为重要的是,它具有胚胎干细胞及神经干细胞无法比拟的优势:自体MSCs易于获得,可大量扩增,自体移植无免疫排斥反应,无伦理道德方面的限制,并且还可能避免了产生肿瘤的危险。MSCs有望成为治疗神经系统疾病的理想的种子细胞。为了寻找更为理想的诱导MSCs分化为神经元样细胞的药物及最佳诱导条件,本试验分别利用三磷酸腺苷(ATP)与神经妥乐平(Neurotropin, NT)作为诱导剂,进行观察比较,以期为临床应用MSCs 移植治疗神经系统疾病奠定基础。方法: 1取一月龄SD大鼠,麻醉后无菌条件下,取双侧股骨和胫骨的骨髓,分离出MSCs,用贴壁法培养,并连续传代、扩增,以获取更纯化的MSCs,连续观察细胞生长情况,以了解其生长特性。 2分别取第2、5、8代细胞,消化后以1×104/ml密度种于 24孔板中,每隔24h按顺序检测3个孔的细胞数,并计算3 中文摘要个孔细胞平均数,连续观察lOd,以时间(d)为横坐标,以细胞数为纵坐标,分别绘制生长曲线,并分别计算出MSCs 在对数生长期的群体倍增时间(population doubling time, PDT)和整个增殖期平均的PDT以及增殖后所得到的MSCs 的理论数值。 3分别用ATP与NT为诱导剂对MSCs进行诱导,比较不同浓度NT对MSCs的诱导作用。 :、lmu/ml、、 、5mu/ml,诱导后分别做巢蛋白(Nestine)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GF:AP) 的免疫细胞化学染色,计算阳性细胞比例进行统计学分析, 选出最佳诱导浓度。 。 的诱导作用。诱导时间可分为:1d、3d、5d、7d、10d,诱导后进行免疫细胞化学染色进行检测,计算出阳性细胞比例,进行统计学分析,找出两药各自的最佳诱导时间。 ,比较两者对MSCs的诱导作用。结果: 1分离得到的MSCs呈圆形,胞体透亮。细胞接种24h后, 少量细胞贴壁,约72h后绝大多数细胞已贴壁,细胞形态为圆形、梭形、多角形,细胞迅速增殖,约8"-'10d达80%融合,此时细胞呈长梭形,按顺序排列成栅栏状。传代后MSCs 贴壁较快,36h内基本完全贴壁,5"---'7d基本铺满瓶底。 2通过绘制的MSCs生长曲线(Fi91)可得出第2、5、8代中文摘要 MSCs的生长情况相同,曲线呈“S”形。传代后第1~2个 24h为细胞潜伏适应期;第3"--'6个24h(共4d)为对数生长期,此期间细胞倍增时间约为33h;第7d开始细胞增殖明显变慢,第8天基本停止,进入平台期。MSCs在整个生长期的平均群体倍增时间约为50h。传4代后MSCs的理论数值为104×27x24/50x4-×108。 "-'5mu/ml区间五种不同诱导浓度对MSCs进行诱导,结果显示随NT浓度增高,NSE与GFAP阳性细胞比例呈先上升再下降趋势,经统计学分析,在NT浓度为 ,诱导NSE与GFAP阳性细胞分别比例为(±)%与(+)%,显著高于其他组。随时间延长,NT诱导的NSE与GFAP阳性细胞比例逐步增多至一定程度后不再增加,Nestine阳性细胞比例呈先上升再下降趋势,经统计学分析,Nestine阳性细胞比例在3d时为(+)%,显著高于其他各组(P<0。01),NSE与GFAP 阳性细胞比例在诱导5d时分别为(±)%与(±、)%,高于其他各组。ATP对MSCs诱导的时间影响趋势与NT基本相同,诱导3d时Nestine阳性细胞比例为(+)%,5d时NSE与GFAP阳性细胞比例为(±、)%与(±)%,高于其他组。比较NT 与ATP在最佳诱导浓度与诱导时间NSE与GFAP阳性细胞比例,经统计学分析,NT的诱导作用优于ATP(P<)。结论: 1MSCs在体外培养条件下具有强大的增殖能力,且生长特性稳定;MSCs在一定条件下可向神经元样细