单增李斯特菌及溶血素O与葡萄球菌三种肠毒素免疫胶体金检测技术.doc

单增李斯特菌及溶血素O与葡萄球菌三种肠***免疫胶体金检测技术沈阳农业大学硕士学位论文单增李斯特菌及溶血素O与葡萄球菌三种肠***免疫胶体金检测技术研究姓名:熊国华申请学位级别:硕士专业:植物病理学指导教师:曹远银曹际娟20070601表,缩略词表,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名:嗜琴时间:,?年,月乎日导师签名(营时间:乡甸年‖月,,“日时间:乡勺,年么月,日关于论文知识产权和使用授权的说明本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名:盈****华时间:碲朗驴日,一导师签名:嗡象时间:,,,年舌月,日,,沈阳农业大学硕士学位论文摘要,单核细胞增生性李斯特菌(,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,)简称单增李斯特菌,是一种人畜共患的致病菌,属李斯特菌属,它可引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症、心内膜炎,流产、死胎及脓肿等,发病者死亡率可达,,,,,,,,,。近年来已有不少国家报道了由于污染单增李斯特菌发生的食物中毒事件。因此,世界各国政府部门对单增李斯特菌引起的食物中毒越来越重视,纷纷制定了一些新的食品安全法规,并把单增李斯特菌纳入法定强检项目。而葡萄球菌肠***(,,,,,,,,;,;;,,,,,,,,,,,,,,,,,,)也是重要?娜诵蠊不疾铮芤鹑说氖澄镏卸竞椭卸咀酆现?,饫喽舅赜泻芏嘀郑治樱牛痢?樱牛隆?樱牛谩?樱牛摹?樱牛拧?樱牛恰?樱龋拧?樱牛珊停樱牛剩渲校樱牛糜址治樱牛貌罚螅牛悖埠停樱牛茫场?本试验首先根据,,,,检索李斯特菌溶血素,(,,)序列(登录号:〔,,:,,,,,,,,,〕),设计引物,常规,,,扩增,并将其产物直接与,,,,,,,载体连接,构建克隆测序质粒,,,,,,,,,,,,进行序列分析鉴定。结果表明,,,,合成的,秒基因序列与检索到的,炒基因序列完全一致。然后用,,,,,和,,,,,分别双酶切,,,,,,,,,,,载体和表达载体,,,,,,,(,),并连接获得重组表达质粒,,,,,,,(十)一,,,。经过双酶切和,,,鉴定正确后,转化到,(;,,,,,,,(,,,)感受态细胞中,构建相应的表达工程菌。利用温度诱导,在,,”,诱导培养,(,,后,该工程菌的,,,(,,,,分析显示,有一条相对分子质量约为,,,,,的表达蛋白区带,与预期的,,,蛋白的大小相符。经,,,,,,,,,(,图像软件分析,重组,,,蛋白(吐工,)以包涵体形式存在,表达量约占全菌蛋白的,,(,,,。根据重组蛋白;端带有,,,,,标签的特征,用螫合镍离子(次氨基三乙酸(,,寸?,,)的亲和层析柱对重组蛋白进行一步纯化。在变性条件下,,,经,,梯度洗脱,目的蛋白出现在,,,(,洗脱液中,其纯度达,,(,,,,经亲和纯化方法可获得约,,,,,,的,,,,蛋白。将单增李斯特菌和纯化后的,,,,蛋白、葡萄球菌肠***免疫新西兰大白兔分别制备抗单增李斯特菌和抗,,,,、,,的多克隆抗体,获得的免疫血清经正辛酸一硫酸铵分步沉淀法和蛋白,亲和层析纯化,其纯度约达,,,,定量抗体浓度约为,,,,,,,间接,,,,,法检测抗体效价为,:,,,以上,,,结果表明所制备的抗原具有很好的免疫原性。纯化后的抗单增李斯特菌、抗,,和抗,,,,多抗,利用胶体金免疫层析技术,采用双抗体夹心法研制了胶体金检测试纸条,用于检测单增李斯特菌、,,和,,,,并对该方法进行特异性、敏感性、稳定性等评价。该检测方法能在,—,,,,,,?完成样品检测,多种不同的菌、蛋白及近缘***检测评价显示该法特异性良好,检测灵敏性高,,,在奶粉、血清、牛奶、火腿肠等环境样品的检测敏感性也相同。其中单增李斯特菌的敏感性达,,,,,,,,,,,,,,的敏感性能达到,,,,,,,,,,,,的敏感性能达至,,,,,,,,,,,,的敏感性能达到,,,,,,,,,,的敏感性能达,,,,,,,,,;,,。,,,天加速试验表明所研制的五种试纸条的稳定性良好,保存期在一年以上。本研究建立的胶体金检测方法灵敏、准确、特异性强,