快速构建哺乳动物细胞表面展示全长人抗体基因库.doc

快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库(可编辑)南方医科大学级硕士学位论文快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库课题来源:业称专名药理学学位申请人贺微指导教师刘叔文教授周辰教授答辩委员会主席张洪泉教授答辩委员会成员邓诣群教授罗焕敏教授张奉学教授吴英松教授论文评阅人马丽英教授周元平教授年月日广州硕士学位论文快速构建哺乳动物表面展示的全长抗体人基因库硕士研究生:贺微指导老师:刘叔文教授周辰教授摘要研究背景:抗体在生物医学领域中应用极为广泛,其制备技术经历了多克隆抗血清一单克隆抗体?基因工程抗体三个发展阶段。自年代德国学者和英国学者利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来,其在临诊断治疗及蛋白质提纯等方面的重要作用日益明显,取得的成果令人鼓舞。但动物源性具有免疫原性,进入人体后会产生不同程度的人抗鼠抗体反应;对清除抗体的器官产生毒性作用;实体组织穿透力差;为异种超敏抗原,对以后注入的失去保护作用,干扰合理分布;此外,成本较高也是难以普及应用的原因之一。基因工程抗体,恰好可以弥补上述不足又称重组抗体,,是指利用重组及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按人们不同需要进行加工改造和重新装配,经转染适当的受体细胞进行表达的抗体分子。的特点是低或无免疫原性、组织穿透力强、分子量小、成本低、可规模化生产等。年国外首次报道了人一鼠嵌合抗体在骨髓瘤细胞中表达成功,以后又出现了各种形式的小分子抗体和抗体融合蛋白。年代以来出现的噬菌体表面展示技术,前制程,菌体筛选中常一日难以展人等过抗体介导细胞介导的细胞毒作用。但由于目前此技术尚不成熟,全长抗体库构建效率低,库容量小,目前文献报道仅达到,难以满足高亲和力、特异性抗体的筛选需要。因此,如何提高建库效率,快速构建大容量的哺乳动物细胞表面展示抗体库是一个必须解决的问题。连接和转化效率是构建大容量抗体库的重要因素之一。虽然增加转化的次数也是增大库容的途径之一,但是通过此方法提高库容量,费时费力,使得大容量抗体库的构建难以广泛开展。电穿孔法是大肠杆菌实现高效转化的最有效方法,嵋连接产物可获得约个转座子。但是在建库过程中由于扩增、半合成寡核苷酸的引入以及多步酶学反应等因素产生的重复克隆、无效克隆及克隆数的丢失、使实际库容要小得多,因此构建大容量抗体库必须对实验设计和实验条件进行优化,提高单次连接和转化的效率及增加连接与转化的次数。首先高效连接是实现高效转化的重要条件,高效连接决定于载体的性质、限制性内切酶的酶切与连接效率、载体与目的基因的比例。合适的限制性内切构建全长轻链和全长重链抗体基因库。其中,所应用的两种限制性内切酶、切割之后的末端均不会自我连接,只有当相匹配的两个末端结合的时候才形成互补而被连接,从而大大提高基因库构建中的连接转化效率,减少了建库的工作量。抗体库技术为新型抗体的研制提供了新的途径。但能否从抗体库中获得预期的抗体受到许多因素的制约,包括抗体库库容、多样性、保存条件、扩增情况以及抗体库的筛选等。而这其中最重要的一步就是要尽量将所有的抗体基因扩增出来,设计并应用一套具有良好扩增效率的引物对于提高库容量,保持抗体库多样性具有重要影响。我们首先根据网站的相应信息设计的对针对抗体重链可变区基因的引物,以及针对抗体轻链链全长基因设计对引物,应用上述引物在个月的时间内成功构建的重链基因库和轻链基因库的容量在一,将重链库和轻链库共转入哺乳动物细胞后,可以利用细胞本身的天然配对机制,使所展示抗体的多样性达到,但是由于引物数目较多,为获得目的基因要做多次,分别纯化产物,操作繁琐。在此基础上,我们根据引物所对应的抗体亚型的表达强度、扩增难易,优化上述引物组合,各用三组引物分别扩增全套重链可变区和全长轻链,且在将其纯化回收后又等比例混合,平衡所构建的抗体基因库中各亚型的比例,以保证抗体库的多样性。在两个星期即完成了库容达到的全长抗体基因库的构建。目的:快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库方法:.总的提取以及第一链的合成取适量静脉血分离外周血淋巴细胞并提取总按试剂盒中的说明书进行操作,测定总浓度。以总为模板,用特异性的引物逆转后导入化学转化感受态大肠杆菌,构建轻链基因库。并取适量转化后的细菌涂于含/氨苄青霉素的平皿,?过夜,根据长出的克隆数计算轻链库容量,收集转化获得的所有菌落即为轻链抗体基因库。以对重链基因扩增产物及载体..进行酶切..经酶切后仍携带有重链恒定区,电泳分离纯化片段,将回收的二种基因片段混合连接,并将连接产物转化感受态细菌。其余构建重链抗体基因库的步骤同轻链基因库的构建。分别从重、轻链抗体库中各挑个单克隆培养过夜后抽提质粒,测序广州英俊公司。.抗体基因转染细胞细胞,。培细胞转染在孔细胞培养板中进行,每孔接种养过夜,然后进行细胞转染。取鹇质粒和止转染试剂,分别用此稀释,放置后