primer5,oligo设计引物.doc

primer5,oligo设计引物最近刚刚始做PCR~考了多引物刚刚相刚的帖子~刚合自己使用参很与primer5和oligo的~想刚刚自己刚刚引体会物的方法和步刚~刚刚各位前刚指正。RT-PCR引物刚刚原刚和方法在NCBI上搜索到刚基因~到刚基因的找mRNA~在CDS刚刚中~到刚刚所在位置~在下面的找区origin中~Copy刚刚刚序列作刚刚件刚刚序列的候刚刚象。打刚PrimerPremier5~点刚sequence,出刚刚入序列口~窗Copy目的序列在刚入;刚刚框内As,~此口~序列也可以直接刚成蛋白。点刚窗内翻Primer~刚入引物口。窗此口可以刚接到“引物搜索”、“引物刚刚”以及“搜索刚果”刚刚~点刚窗Search按刚~刚入引物搜索~刚刚框“PCRprimers”~“Pairs”~刚定搜索域和引物刚度和刚物刚度。在区SearchParameters里面~可以刚定相刚参数参数即当。一般若无特殊需要~刚刚默刚可~但刚物刚度可以适刚化~因刚100,200bp的刚物刚泳得刚散~跑所以可以刚刚300,500bp。点刚OK~刚件刚始自刚搜索引物~搜索完成后~自刚跳出刚果口~搜索刚果默刚按照刚分;即会窗Rating,排序~点刚其中任一搜索刚果~可以在“引物口”中~刚示出刚引物的刚合情~包括上游引物和下游引物的序个窗况列和位置~引物的各刚信息等。刚于引物的序列~可以刚刚刚看一下~避免出刚下列情,况3’端不要以A刚尾~最好是G或者C~T也可以~3’不要出刚刚刚的3个碱况基相刚的情~~否刚容易引起刚配。此口中需要着重刚看的包括,窗Tm刚刚在55,70度之刚~GC,刚刚在45,,55,刚~上游引物和下游引物的Tm刚最好不要相差太多~大概在2度以下刚好。刚口的最下面列出了引物的二刚刚信息~包括~刚~二聚~引物刚交叉二聚和窗两条构卡体体刚刚引刚位置。若按刚刚示刚刚色~表示存在刚二刚刚~点刚刚刚色按刚~可看到相刚二刚刚位置刚示。最理想的引物构即构~刚刚都不存在刚些二刚刚~刚刚刚按刚都刚示刚“构即几个None”刚好。但有刚刚到各件都刚足的引物~所以要求很找个条可以适放刚~比如引物存在刚配的刚~可以就具情考察刚刚配的效率如何~是否明刚影刚物。刚于引物当体况会响具刚刚的刚价需要借助于体Oligo来完成~Oligo自身刚然刚有引物搜索功能~但其搜索出的引物刚量感刚不如Primer5。在Primer5窗窗口中~若刚得某一刚引物合适~可以在搜索刚果口中~点刚刚引物~然后在菜刚刚~刚刚pair~使用PDF虚即刚打印机~可刚刚刚Pdf文~里面有刚引物的刚刚信息。档在Oligo刚件界面~File菜刚下~刚刚Open~定位到目的cDNA序列;在primer中~刚序列已刚被保存刚Seq文件,~跳出口~分刚刚会来两个窗InternalStability;DeltaG,口和窗Tm窗口。在Tm窗口中~点刚最左下角的按刚~出引物定位刚刚~刚入候刚的上游引物序列位置;会来框Primer5已刚刚出,可~而引物刚度可以通刚即点刚ChangeCurrentoligolength来改刚。定位后~点刚Tm窗口的Upper按刚~定上游引物~同刚方法定位下游引物位确置~点刚Lower按刚~定下游引物。引物定后~可以充分利用确确即Analyze菜刚中各刚强大的引物分析功能了。Analyze中~第一刚刚Keyinfo~点