两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则.docx

两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则.docx两种定量分析方法的比较及Taqman探针、引物设计原则遗传物质DNA首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA(mRNA),携带遗传信息的mRNA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合,在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽,多肽经过进一步加工后变成蛋白质,至此遗传物质DNA完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤,所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少,所以通过对细胞内某条基因mRNA含量多少的分析,就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置,PCR扩增和检测同时进行;在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。定量PCR常用的三个常用概念扩增曲线、荧光阈值、Ct值扩增曲线:反映PCR循环次数和荧光强度的曲线,定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动记录荧光强度的变化荧光阈值:样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,。CT值: PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。扩增曲线荧光定量PCR的数学原理理想的PCR反应:X=X0*2n非理想的PCR反应:X=X0*(1+Ex)n(n:扩增反应的循环次数;在扩增产物达到阈值线时:X:第n次循环后的产物量;X0:初始模板量;Ex:扩增效率)XCt=XO(l+Ex)Ct=M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量,在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logXO(l+Ex)Ct (2)整理方程式⑵得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)由此可见,logXO浓度与循环数呈线性关系,根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的该基因的初始模板量。一丫X厂BothcoJo<$厂Log厂AutowoleSmooth:—」y・4)28x>1103;rA2・0999FShowwlectodwefts利用相对定量的方法分析目的基因的表达研究基因表达的情况,我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了,而无需知道该基因的绝对量有多少。基因表达调控研究中,由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素,用于定量分析的初始样品浓度不同,这就造成了卅品初始浓度不同而造成的差异。所谓的看家基因即内参基因,是指在备生理阶段表达量恒定的基因,也称奢侈基因,该基因表达一般不随外界的变化而变化,所以常被用作参照,常用的内参基因有GAPDH基因、|3-Actin基因,18srRNA基因等。因此,在做基因表达调控分析时至少要做两个基因,目的基因和一个看家基因。假定在1生理时期,X基因的表达量为XI;其内参基因表达量为Yl;X1/Y1就将1生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均