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引物纯化方式选择指南.doc


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引物纯化方式选择指南.doc
文档介绍:
引物纯化方式选择指南2012-2-1610:24:14内容导读一、DNA合成的方法和原理二、引物纯化的方法原理及其效果三、纯化方法与应用指南四、常见问题的原因分析及相应的对策一、DNA合成的方法和原理目前引物合成主要采用固相亚磷酰***三酯法进行。基于该方法的DNA合成仪有多种,由ABI/PE公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。各合成仪进行引物合成的原理基本相同,主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。固相亚磷酰***三酯法合成DN***段,具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的,DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’→3’方向延伸,而是由3’端开始,相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如图一。1、脱保护基(Deblocking)用三***乙酸(TrichloroaceticAcid,TCA)脱去连结在CPG(ControlledPoreGlass)上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯***),获得游离的5'-羟基端,以供下一步缩合反应。2、活化(Activation)将亚磷酰***保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱,形成亚磷酰***四唑活性中间体(其3'-端已被活化,但5'-端仍受DMT保护),此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。3、连接(Coupling)亚磷酰***四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时,将与其5'-羟基发生亲合反应,缩合并脱去四唑,此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。4、封闭(Capping)缩合反应后,为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸,常通过乙酰化来封闭此端羟基,一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-***咪唑等混合形成的。图1:DNA合成原理示意图(固相亚磷酰***三酯法)5、氧化(Oxidation)缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接,而亚磷酯键不稳定,易被酸、碱水解,此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯,得到稳定的寡核苷酸。经过以上五个步骤后,一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上,同样再用三***乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5'-羟基上的保护基团DMT后,重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到DN***段粗品。最后对其进行切割、脱保护基,合成的Oligo在脱去保护基后,目的Oligo纯度是比较低的,其中含有大量的杂质。主要杂质有:所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨,***磷基上脱下的***乙基,以及合成时产生的短链等。以至于粗产品中全长OligoDNA含量仅为25%左右。尽管合成时每一步的效率都在98%~99%,但累积的效率并不高。这些杂质成分,尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链,不但造成定量不准,还会影响下一步的反应。因此必须对OligoDNA进行纯化、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。二、引物纯化的方法原理及其效果基于以上合成的原理和步骤,目前,常见的几种纯化方法如C18柱、OPC或HAP、PAGE、HPLC。生工公司采用HAP、ULTRAPAGE、HPLC三种纯化方法,其纯化的原理及其效果分别如下,我们建 内容来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.
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  • 上传人xiang1982071
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  • 时间2020-08-07
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