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微卫星引物筛选步骤.doc


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微卫星引物筛选步骤.doc
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1.进行酶切用VspⅠ对四种鱼(GC、GS、NL和ZZ)基因组DNA(需基因组DNA浓度较高)进行酶切。反应体系为:ddH2O15µLVspⅠbuffer2µLVspⅠ酶1µLDNA2µL总体积20µL酶切在37℃反应3~4h即可,但是为了提高酶切效率可切4~6h。PCR反应程序为:94℃5min,(94℃1min,53℃1min,72℃1min)×30,72℃10min,4℃hold。VspⅠ酶即(AseⅠ酶):酶切识别位点为:5’AT↓TAAT3’5’TAAT↑TA3’AseⅠ酶的接头为:A1:5’3’A2:5’TAGGTACGCAGTC3’AseⅠ酶用的预扩增产物为:A3:5’TAAT3’2.接头制备用10µLA1(200µM)和10µLA2(200µM)混合,94℃3min后室温放置30min。3.酶切片段与接头连接接头为A1和A2制备的接头,命名为AE。连接反应体系如下:ddH2O5µLT4ligation酶0.5µLT4buffer4µL酶切产物20µLATP(10mM)0.3µLAE1µL总体积30.8µL上述混合体系在16℃连接过夜。10h左右。4.连接产物PCR扩增对连接产物进行PCR扩增,每个样本做4管。扩增引物为A3。反应体系如下:ddH2O14µL10×buffer2.5µLMg2+2µLdNTPs(10mM)0.5µLA31µLDNA(连接产物)5µLTaqE(2.5U/µL)0.2µL总体积25.2µLPCR反应程序为:(94℃30sec,56℃1min,72℃1min)×20,72℃10min,4℃hold。5.检测扩增产物扩增产物大小应在750bp左右,即400~1000bp较好。6.回收扩增产物将同一样本的扩增产物收集于一个EP管中↓向其中加入1/10总体积预冷的3MNaAC和2倍体积预冷的无水乙醇(或者等体积预冷的4MNH4AC和2倍体积预冷的异丙醇)↓-20℃放置30min(该步可在-20℃长期保存)↓室温,12000rpm离心10min↓弃上清,加入1ml左右70%乙醇洗涤一次↓室温,12000rpm离心5min↓弃上清,干燥后加入20µLddH2O溶解即可(可以根据沉淀量加入ddH2O)7.配杂交体系取250~500ng回收DNA与50~80pmolbio-SSR探针混合,使SSC和SDS终浓度分别为4.2×SSC和0.07%SDS。具体杂交体系如下:ddH2O74.5µL20×SCC21µL10%SDS0.7µL回收产物3µLbio-SSR探针(AC)150.8µL总体积100µLPCR反应程序为:95℃5min,在58℃可以保存,但是不能时间长。在此过程中可以准备磁珠。bio-SSR探针序列可以为(AC)10、(AC)15、(AC)12或者AG重复均可,这个可以根据基因组序列确定。8.磁珠准备1)2mgbeads(200µL)(根据DNA沉淀的多少决定所用磁珠的量,在100~200µL之间,在解冻磁珠时应轻柔的上下颠倒,不能用力)放置在磁力架上,使其吸附到EP管的一侧,然后从另一侧吸弃清液,再加入1mLTEN100洗涤,轻柔颠倒混匀,使磁珠和TEN100充分混合2min左右,然后放到磁力架上吸附,如此反复3次即可。2)用40µLTEN100溶解最后一次聚集的磁珠。3)为减少特异性吸附向上述混合液中加入2µ 内容来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.
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  • 时间2020-08-07
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