害虫抗药性分子检测技术发展现状.doc

,,,2o()6害虫抗药性分子检测技术发展现状曹晓梅赵彤言(军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室,北京100071)摘要记述8种当前用于害虫抗药性检测的分子生物学方法:专一性等位基因PCR扩增;PCR一单链构象多态性;固相微测序反应;限制性片段长度多态性;PCR一寡核苷酸探针斑点杂交;随机扩增多态性DNA;Northern斑点杂交;,;抗药性;分子检测近年来生物杀虫剂的研究工作取得很大进展,但其应用范围,应用效果及经济效价还很难达到害虫控制的目的,从某种程度上说未来几十年,化学杀虫剂仍然是控制害虫种群的主要方法,而杀虫剂的选择压总会造成害虫的抗药性,因而抗性治理将是延缓和减低抗性进程,,便宜,有效,能区分SS,RR,RS基因型的抗性检测方法,才能改变传统生测法的抗性监测总是落后于抗性发展的被动状态,验证计算机模拟理论,进行抗性测报,从而达到害虫控制目的,(PASA,PCRAmplificationofSpecificAlleles,也称为AS—PCR,Allele—SpecificPCR)技术的原理是在一端设计2条等位特异性引物(野生型和突变型),突变碱基在引物的3端或靠近3端,,在以突变型引物扩增正常DNA模板时,其3端就形成了错配,延伸反应就会因磷酸酯键难于形成而不能进行,也就得不到特异长度的条带,从而表明模板DNA无此突变;如果PCR结果能得到特异长度扩增条带,:*通讯作者Email:将野生型和突变型引物分别用于同一DNA模板的扩增,即可根据扩增片段的凝胶电泳直接诊断出有无某种基因突变,—PASA(BidirectionalPCRAmplificationofSpecificAlleles)技术设计2个非特异性外引物(P,Q)和2个等位基因特异性内引物(A,B),2个外引物在距突变碱基不等距离的上下游处与模板配对,2个内引物的3端分别与模板的敏感和抗性碱基配对,将模板DNA和3条引物置于同一PCR反应体系,在合适的反应条件下,纯合子RR,SS和杂合子Rs的PCR产物在电泳胶上就会呈现特异性的条带,从而区分抗性,敏感纯合子及杂合子(图1).Kwok等(1989)最早用人类免疫缺陷1型病毒(Humanimmunodeciencvvirustype1)为模板,研究了在PCR反应中引物与模板错配对产物的影响,结果显示,引物内部的单碱基错配对PCR产物没有影响,(1997)研究了复式(Overlapping)PCR单管Bi—PASA的试验条件,如扩增反应中的动力学,影响Bi—PASA的各种参数,引物之间的相互作用,在此基础上提出了优化Bi—PASA反应的试验方案,如引物如何设计,引物浓度使用情况,对产物敏感性和特异性的检测,,Steichen等(1994)首次利用PASA技术成功检测了环戊二烯类杀虫剂抗性?57?寄生虫与医学昆虫第13卷第1期AB,Q.-PossiblePCRSegmentsPQwildlypePQmutantPQMutantAllcteAQWildtyp~AllelePBAQmutantlAgarosegeldec曲…,Q为非特异性外引物,A,-(Drosophilamelanogaster)和相似果蝇(Drosophilasimulans)(GABA)(1996,2000)利用改进的竞争性PASA技术鉴定了谷硫磷抗性马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)乙酰胆碱酯酶的一个点突变和苏云金杆菌(胁)内***抗性印度谷螟(Plodiai