RNA干扰沉默STAT5A基因诱导肝癌细胞HepG2凋亡.pdf

结果···⋯⋯···参考文献⋯英汉缩略词对照表⋯⋯⋯胫琢鲋瘟频难芯拷综述细胞蛲觥讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯致谢·····································································ぁぁぁぁぁぁぁぁぁぁぁ璉
/丫痩驛干扰沉默基因诱导肝癌细胞蛲摘要的转染效率,以每孔脂质体、重组质粒襞涑勺H靖春衔铮尤敫目的:探讨针对基因的泶镌靥宥匀烁伟┫赴礖细胞中基因表达的特异性抑制作用及其对肝癌细胞凋亡的影响,为干扰蜃魑V琢龌蛑瘟菩虏呗缘挠τ锰峁┦笛橐谰荨7椒ǎ设计跽攵許虻腞干扰靶序列虶’瑀,合成具有该靶序列短发夹结构的寡核苷酸,退火形成双链=,纯化回收大片段。将退火形成的双链ü齌酶连接到线性化质粒启动子下游,构建重组表达质粒...=刈质粒转化感受态细胞,经。抗性和致死基因筛选,挑选阳性克隆菌落进行摇菌扩增,并抽提纯化质粒,然后将抽提的重组质粒进行单酶切和琼脂糖电泳分析,同时做测序鉴定以确定插入的干扰片段准确无误,即针对基因的泶镌靥骞菇ǔ晒ΑMü菇ú针对任何基因的跣远哉誴.。培养赴赴生长状态良好并达到指数生长期时,于转染前一日接种于装逯校⑸置空白细胞对照组、阴性对照组、.。用表达绿色荧光蛋白的约觳飧伟┫,荧光显微镜下观察绿色荧光
细胞所占比例,以此来判断转染效率。接着用试剂分别提取各组细胞总,并应用核酸定量分析仪及琼脂糖凝胶电泳检测所提取本的浓度、纯度以及完整性。以各组总D0澹珿视腿磷酸脱氢酶D诙哉战辛讲椒孀B季酆厦噶捶从.,琼脂糖凝胶电泳分析,并用灰度半定量检测各组蠖另在转染后蠪疨久孔橄赴罅魇较赴羌觳庀赴蛲銮况。结果:①..ê筒庑蚣ㄖな的康男蛄已准确插入到预计位点,重组质粒构建成功。②以染赴荧光显微镜下观察,转染效率约为%以上。扩增产物凝胶电泳分析显示:各组泳道中内对照┰霾物条带牧炼认嗨疲鳶干扰组、.扇抛槔增产物条带牧炼染飨匀跤谄渌椤;叶壬璋攵拷峁示,空白细胞对照组、对照组、.扇抛椤干扰组赴蠸的相对表达量分别为士、、..士。经煅榉讲罘治觯琒干扰组、.扇抛镾相对表达量分别与空白组、阴性对照组相比,,而空白细胞对照组与组之间相比,无显著性差异."芡ü式细胞仪检测细胞凋亡率百分显示:.扇抛椤干扰组细胞凋亡显著,凋亡率分别为.%和.%;空白细胞对照组与组细胞凋亡无显著性差异。结论:①设计合成的扇判蛄凶既肺的相对表达量;和
误地克隆到表达载体中,针对基因的泶镌靥骞建成功。②针对基因序列构建的体内表达载体在水平特异性地抑制赴蠸谋泶铩"墼擞肦干扰沉默肝癌细胞中基因表达,能诱导人肝癌细胞凋亡,可成为肿瘤基因治疗的有效方法。关键词:扇牛籹表达载体;基因;基因治疗:肿瘤;凋亡
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原发性肝癌的恶性肿瘤,有“癌中之王’’之称,近年来死亡率增加了.%,已成为我国居第二位的肿瘤【。目前肝癌的常用治疗手段是手术、放、化疗,这些手段虽可使患者在一定程度上提高生存率,但仍然具有诸多弊端,如术后复发及远处转移等。随着对肿瘤发生发展分子机制研究的不断深入,恶性肿瘤的基因治疗已经成为当前肿瘤治疗探索新的方向,肝癌的基因治疗研究亦成为一个重要领域。然而,在肝癌的基因治疗中,作用靶点和方法的选择是实现有效治疗的关键。,信号转导子和转录激活因子琒且恢执嬖谟谙赴⒃诩せ詈竽芄蛔H牒四谟隓结合的独特的蛋白家族,该信号通路接受生长因子、细胞因子等细胞外信号刺激,作用于细胞核内特异的危骺匕谢蜃B迹跋煜赴的增殖、分化和凋亡,参与肿瘤的发生和演进【【。目前易逡延龀稍北环⑾郑碨~蚐,鯯蛋白大小均为个氨基酸,基因起源于同一原始的基因。具有很强的抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用,参与了人类多种恶性肿瘤的发生、发展和演进,其中斐<せ钣胫琢龅男纬擅芮邢喙亍现在,一般认为且桓霭┗颍谙赴癖涔讨衅鹬匾W饔茫持续活化的銮苛讼赴淖;ü碳は赴脑鲋澈鸵种葡赴亡等机制促进肿瘤的发生和发展。大量研究表明,在多种肿瘤细胞系和多刖琱琀撬劳雎首罡声.』.