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肝脏巨噬细胞(kcs)的分离培养.ppt

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肝脏巨噬细胞(KCs)的分离与培养肝脏细胞悬液制备门静脉穿刺,以10ml/min流量经门静脉灌注PBS,直至肝脏呈黄白色,总量约20ml。%的Ⅳ型胶原酶溶液(sigma,PBS液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤)。%胶原酶,37oC孵育40min,经200目细胞筛过滤。PBS稀释至50ml,300×g5min,4oC,离心洗涤2次,取沉淀PBS稀释至50ml,用50g×g3min,4oC离心,弃沉淀,将上清液以300×g,5min,4oC离心,取沉淀。用镊子划碎肝组织装入试管消化肝脏消化吹打后细胞悬液细胞悬液过滤洗涤与肝细胞沉淀梯度离心Percoll原液9份加入1份PBS(10倍浓度)配成100%的SIP。取4支无菌离心管,沿着管壁加入2mL50%的SIP,然后倾斜(60o)试管,轻轻的沿着管加2mL25%的SIP细胞悬液(小鼠2管,大鼠4管)。500×g,离心15min,4oC,50%的SIP和25%的SIP层面之间有一层白色物,吸管轻轻的吸取之,置离心管中,用PBS离心清洗2遍,弃上清(300×g,5min)。非肝细胞SIP离心准备SIP离心后细胞层与洗涤

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巨噬细胞培养