几种蛋白质定量测定方法的比较.ppt

实验一几种蛋白质定量测定方法的比较生物化学与分子生物学基础实验1掌握紫外吸收法、Folin-酚试剂法(Lowry法)和考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质含量的原理和方法2掌握分光光度计的原理和使用方法实验目的生物化学与分子生物学基础实验①有多少样品可供分析;②蛋白质样品浓度大约是多少;③样品中含有哪些可能影响定量的化学物质;④所选方法是否简单、可靠;⑤含量测定的专一性要求是否很高。选择合适的蛋白质含量测定方法主要基于几点考虑:生物化学与分子生物学基础实验常用的方法物理性质:紫外吸收法化学性质:Folin-酚试剂法(Lowry法),BCA法(Bicinchoninicacid法),凯氏定氮法,双缩脲法(Biuret法),胶体金测定法,等等染***质:考马斯亮蓝染色法(Bradford法)、银染法测定绝对含量应用凯氏定氮法(蛋白质的含氮量为16%)。生物化学与分子生物学基础实验蛋白质在紫外光区(190nm-360nm)有两个强烈吸收峰:280nm和190nm。280nm有吸收的电子所需能量较少,因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中,色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香环,可吸收280nm波长的光子,苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关,因此相同浓度的不同种类蛋白质,其280nm的吸收值差别很大(图1)。。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明胶(G)的吸收光谱,缓冲液为:%Brij35,,5mMKH2PO4,pH7。图B是10μg/mlRNA和DNA的吸收光谱。生物化学与分子生物学基础实验肽键在190nm有强吸收峰。一般分光光度计在190nm的光强较弱,且O2在此波长有吸收,因此通常使用205nm或210nm波长,Trp,Phe,Tyr,His,Cys,Met,andArg的侧链在此波长有吸收。优点:灵敏,较稳定。缺点:干扰因素多。许多化学物质特别是含C=C双键和C=O双键的物质在此波长范围有吸收,所以必须严格控制反应条件。紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验优点:不需添加任何试剂,因而对样品没有任何破坏;测量极其简单迅速;蛋白浓度和吸光度是线性关系,容易计算。适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验缺点:干扰测定的影响因素多,尤其是RNA和DNA在此波长均有强吸收,,必须严格控制样品溶液的pH和化学组成,使待测样品和标准样品的实验条件一致。敏感度低,要求样品的浓度较高,量较大。用标准曲线法测定蛋白质含量时,对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,误差较大。紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验管号01234567标准蛋白溶液(ml)(ml)(mg/ml)(ml)-------