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实验二植物基因组DNA的提取笔记.doc


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实验二植物基因组DNA的提取Tris读音“吹斯”脱氧核糖核酸酶DNase是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶DNaseI活性依赖于钙离子,并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下,DNaseI可随机剪切双链DNA的任意位点;二价锰离子存在条件下,DNaseI可在同一位点剪切DNA双链,形成平末端,或1-2个核苷酸突出的粘末端。苯酚在空气中经常被氧化生成醌,它能够产生自由基,直接用于DNA分离,会使磷酸二酯键断裂,造成DNA降解。苯酚使蛋白变性,离心时沉淀下来,而DNA溶解在溶液中。在提取DNA时用的原料成分的关系,很多植物源提取材料里面含有酚类物质,,为有效除去酚类物质,需要在研磨时加入抗氧化的PVP,用PVP是利用它的“CO-N=”基有很强的结合多酚化合物的能力,其结合能力随多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强,结合成复合物后,通过离心除去。另外,在加入提取液时,加入B-巯基乙醇可使多酚氧化酶失活,防止酚类物质被氧化,主要是“-SH基”可以打断多酚氧化物酶的二硫键而使之失活,防止酚类化合物被氧化。巯基乙醇加入的目的是提供一种还原剂,这样酚类物质就不能被氧化成醌,从而影响你提DNA的实验。巯基乙醇兼有这两方面功能,消泡和保护DNA。特别是样品中酚类物质较多的时候,可以适当增加巯基乙醇的量,DNA提取的成功率更高。巯基乙醇有消泡的作用。不然你加了CTAB在震荡过程中会出现大量气泡,影响后续操作。不是用来防止DNA氧化的。PVP粉才是用来防止氧化的。还原剂,防止酚的氧化。很重要。如果不加提出的核酸会呈现灰黑色。异戊醇的作用是消除抽提过程中出现的泡沫。我们实验室是灭菌后加PVP和巯基乙醇,每次用前65度水浴。加CTAB时应在通风橱中进行。RNase是一种核糖核酸内切酶,即RNA(水解酶)它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键,故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。RNaseA对RNA有水解作用,但对DNA则不起作用。可以用来去除DNA制品中的污染RNA。λDNA/HindⅢMarker是由λDNA经HindⅢ完全酶切并经灭活处理而成,共有8条DN***段,已加入上样缓冲液,可直接电泳,每次上样5μl,。bp):125、564、2027、2322、4361、6557、9416、23130储存:-20℃可保存一年以上,4℃可保存2-3个月。目录号包装价格MD202--(聚乙烯吡咯烷***):加入PVP的目的是使PVP吸附酚类物质,这样就可减轻酚类物质对你所提DNA的影响。PVP是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。PVP为一种水溶性高分子聚合物,化学名称为聚乙烯吡咯烷***,是一种有机物。个人认为不适合提前加入和CTAB提取液一起高压灭菌。我们实验室是灭菌后加PVP和巯基乙醇,每次用前65度水浴。加CTAB时应在通风橱中进行。聚乙烯吡咯烷***PVP-

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  • 时间2020-09-25