hBMP-6基因修饰骨髓间充质干细胞治疗类风湿性关节炎实验的研究.pdf

山东大学博士学位论文 hBMP一6基因修饰的骨髓问充质干细胞治疗类风湿性关节炎的实验研究博士研究生:魏璐婉博士生导师:刘执玉教授专业:人体解剖与组织胚胎学中文摘要骨髓腔内含有造血和基质两大细胞组织系统。前者由造血干细胞及其分化的造血细胞组成,后者是一个异质细胞群体,包括成纤维细胞、网状细胞、脂肪细胞、巨噬细胞及内皮细胞等,其中含有多能干细胞(multi—potential stem cell),亦称为骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cell,BMSC)。又由于其来源于中胚层的问充质,系胚胎发育过程中少量原始间充质细胞迁移填充组织间隙时定居骨髓腔而来,并且可在特定情况下分化为间充质来源的各种组织以修复缺损, 所以又被称为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)。1986年, Friedenstein等最早证实了骨髓间充质干细胞的存在。骨髓问充质干细胞是一类可进行自我复制和更新的细胞,在不同的理化环境和细胞因子的诱导下能够跨胚层向骨、软骨、脂肪、神经、肌肉等多种谱系分化。骨髓间充质干细胞的主要优点有:1、易于从自身取材,无免疫排斥反应之忧,因而也就更易为病人所接受; 2、成体干细胞,涉及较少伦理问题:3、体外易于扩增。易分离、扩增以及体外操作简便。基于骨髓间充质干细胞的以上优点,其在组织器官缺损性疾病,组织器官退行性疾病,遗传缺陷性疾病等方面都有重要的应用前景。类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、自身免疫性、炎症性关节病。表现为对称性多关节炎性病变,可侵犯多个大、小关节,并伴有晨僵,乏力,体重减轻及全身多器官、多系统受累。其病理特征为滑膜血管的增生与炎性细胞的浸润,后者进一步导致滑膜、软骨乃至软骨下骨组织的受损,最后引起关节破坏。类风湿性关节炎的发病机制尚未完全明确,因而还缺乏特异性治疗措施。目前临床上的治疗方法有:l、非药物性物理疗法2、药物治疗3、自体造血干细山东大学博士学位论文胞移植(HSCT)4、基因治疗5、外科手术治疗等。然而,现有的治疗方法主要是控制症状,延缓病情的发展,调节机体的免疫应答反映。但是对于已经发生的关节内软骨及骨损伤,仍然没有很明显的疗效,寻找和探讨新的有效治疗方法,成为医学工作者的义不容辞的责任。随着骨髓间充质干细胞研究的深入发展,采用干细胞治疗某些疑难病症的研究探讨临床上已经有诸多报道,但采用骨髓间充质干细胞治疗类风湿性关节炎的研究尚属少见,本研究将为类风湿性关节炎的治疗开辟了一个新的途径。骨形态发生蛋白(bone ic proteins,BMPs)属于转化生长因子一D(transforming growth factor B,TGF一13)超家族的成员,1965年Uri st 等人首先从脱钙骨基质提取物中分离得到的一种具有活性的蛋白质,这种蛋白具有使未分化的间充质细胞定向分化为成骨细胞,并进而可合成胶原性蛋白,形成钙化的骨组织能力,因此命名为骨形态发生蛋白。在体(in vivo)和离体(in vitro)实验表明BMPs具有调节成骨细胞和成软骨细胞的分化,诱导异位骨形成, 促进骨折愈合,及其具有控制哺乳动物骨骼不同形态特征形成的功能。随着研究的深入,研究者发现BMPs的生物学作用不仅限于骨的发育和形成,而且几乎涉及全身所有系统,包括心血管、胃肠、呼吸、泌尿生殖、体被及神经系统的胚胎发育、生长和分化。目前,己确认的BMPs家族成员达40多个。BMP一6最初是从鼠胎盘cDNA文库中分离得到的,并根据其与爪蟾属相类似,被命名为生长相关苍白基因(Vgr一1)。1990年Celeste等从人的胎盘及胎脑cDNA文库中分别克隆到Vgr一1的同源基因,根据它与BMP家族的同源性而定名为hBMP-6。研究表明, BMP一6能启动软骨细胞成熟,诱导间充质细胞向成软骨细胞方向分化,是软骨细胞分化的一个自分泌刺激因子。目前关于BMP一6诱导或是作为目的基因整合入 MSCs诱导其分化的研究国内外仍然较少。基于以上研究背景,我们拟建立类风湿性关节炎的大鼠模型,体外分离培养扩增骨髓间充质干细胞,利用腺病毒载体,介导hBMP一6基因转染MSCs,并注入模型关节内,诱导达到抗炎及软骨修复的双重治疗效果。 6 目的构建携带hBMP一6目的基因的腺病毒载体;转染骨髓间充质干细胞,使其在关山东大学博士学位论文节炎模型大鼠体内分化为软骨细胞并分泌目的基因蛋白,为骨髓间充质干细胞临床治疗类风湿性关节炎提供新的思路和实验依据。方法 、培养、鉴定:取幼年Wistar大鼠股骨和胫骨髓腔内细胞,用贴壁培养法分离骨髓基质干细胞,培养、传代并纯化。细胞纯化后,用流式细胞仪检测干细胞表面抗原CDl4,CD20,CD34和CDg