WB实验基本步骤.docx

实验基本步骤提取细胞蛋白↓BCA定量↓制备蛋白胶(SDS-PAGE胶)↓蛋白样品变性↓电泳↓转膜↓封闭↓一抗↓TBST洗涤↓二抗↓TBST洗涤↓显影↓***化钠8g***,调PH=,(PBS+%吐温-20)500mlPBS+-,置于4℃(1X)10x稀释,50ml10x电泳液+(TBS+%吐温-20)50mlTBS+450ml纯水+-+5%奶粉40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉,40℃预热WB实验一、蛋白样品制备准备:一管细胞,PBS(4℃预冷),PMSF(100mM),移液枪(1000ul,10ul),,高速冷冻离心机4℃预冷于-20℃冰箱中取出一管细胞样品,吸去培养液加入1ml4℃预冷的PBS(~)。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃,8000r离心5min,然后弃去上清。重复以上操作一次,共洗细胞两次以洗去培养液。(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。),吹匀,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。,于4℃下12000rpm离心5min。-20℃保存。二、蛋白含量的测定(BCA定量)准备:96孔板,移液枪(1000ul,10ul,200ul),BCA工作液(A+B),50mlEP管,1xPBS,BSA标准液将96孔板分好区域,若不够分则只做两个重复,(外围一圈的孔最好不用)算好孔数(总的)每孔加200ulBCA工作液(A+B),(A液:B液=50:1,一般配多些,如60孔,A液12000ul,B液240ul)将样品稀释到一定倍数才能定量,(10倍,20倍,30倍),每孔需要20ul样品(2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍),做三个重复则需要60ul,一般配80ul配蛋白标准样品,将2mg/,(标记的区域),接着标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域,之后在加标准样品的孔内,将孔内溶液用PBS补足到20ul每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差将加好的96孔板放在37℃下孵育30分钟孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量(ml)为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。(R2>,酶标仪操作:两个箭头图标,1是结果,2是保存)计算蛋白含量(注意定量样品已经稀释了10倍)蛋白质定量标准曲线加样量序号12345678标准蛋白量/ul(