RT-qPCR操作说明书.docx

注意事项以下的Protocol主要适用于(1)所使用的DNA1反转录酶、RNA酶抑制剂以及dNTPs±匀是Fermentas公司的;而在qPCF中,所使用的Supermix是Bio-RAD公司的。RT-qPCF中的注意事项:MgC2的浓度2~4mM模板的浓度50ng~5pg之间;引物的浓度,500nM比较合适,~1uM之间选择;退火温度的选择,首次设置比实际小5C的,之后在1~2C选择;引物设计的时候Tm值最好在60C附近,正反向引物的Tm的差值在1~2C之间;抽提得到的RNA需要验证RNA勺纯度,最好验证一下RNA的完整性;在qPCR中,模板的体积要小于总反应体系的10%(主要是模板的加入量会影响反应体系中的MgC2浓度);(8)扩增曲线一定要做。通常如果有条件也要做退火温度梯度,以获得最佳的退火温度。另外就是,一块板子上,尽可能取尽量多的样本,而不是基因;(9)扩增效率在90~110%的范围内是可以接受的;(10)内参基因的选择,尽可能选择与靶基因处于同一信号通路有关引物设计扩增子长度小于150bp;引物Tm的理想值57~60C;3’端最后5个碱基里面G或C的含量少于三个;GC含量介于20~80%理想值40~60%避免引物二聚体及自身二级结构;避免引物内的自身重复序列;在一个实验中不论是绝对定量还是相对定量都需要做标准曲线,做标准曲线的方法,以反转录得到的cDNA为模板,用qPCR的引物做PCF得到的产物为模板,产物先稀释10000倍,以稀释后为基底,以10为倍数,稀释7~8个梯度(稀释点越多,稀释倍数越大,数据越精确),做qPCR然后得到标准曲线。利用标准曲线可以验证下列因素:(1)扩增效率;扩增效率E=10-1/斜率-1标准品的梯度范围;PCR抑制剂的存在于影响;PCR仪验证灵敏度。注:如果使用反转录的试剂盒,那么从反转录开始则会有试剂盒的使用说明书,之后的步骤都按照说明书来!(ACVY,清洗细胞!加入1ml的TRIzol,使用移液枪打匀几次!室温下,孵育5min;加入200ul的***仿(每ml的TRIzol)。用手剧烈震荡15s,室温孵育2~3min;<12,000g,4C离心15min;小心移取无色相到新的离心管中!RNA沉淀:(每1ml的TRIzol)。室温下孵育10min;<l2,000g,4C离心15min(通常情况下,离心之前RNA是可见的)。洗:移去上清,加入1ml的75%勺乙醇(每1ml的TRIzol),轻轻涡旋混匀,£500g,4C离心5min;稍微的风干RNA(不用风干的太狠),使用50ul的RNA-freeWater溶解RNA用移液枪混匀几次,55~60C孵育10min,测得浓度,部分溶解的RNA的A260/A280值<.-80C保存或者是直接使用!除去RNA中的DNADNAE处理RNA<50ug10buffer3uLDNaseI1-5U(根据RNA的量和DNA勺实用说明)RNA-freewaterUpto30uL37C条件下孵育60min加入1卩I的50mM的EDTA之后65C孵育10min,