营养缺陷型菌株的筛选方法.ppt

营养缺陷型菌株的筛选方法材料收集:徐正炀车通周浩什么是营养缺陷型菌株?经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养(氨基酸,维生素,核酸等)的能力,只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长的野生型菌株。它是一种生化突变株,它的出现是由基因突变引起的。遗传信息的载体是一系列为酶蛋白编码的核酸系列,如果核酸系列中某碱基发生突变,由该基因所控制的酶合成受阻,该菌株也因此不能合成某种营养因子,使正常代谢失去平衡。超阻遏突变体(表现为营养缺陷型)营养缺陷型菌株的分离和筛选4个步骤:1、诱变培养2、淘汰野生型3、检出营养缺陷型4、鉴别缺陷种类,确定生长谱一、诱变培养营养缺陷型的诱变方法和诱变因子与普通诱变育种基本相同。用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍,紫外线,亚***等,其中亚硝基胍的诱发突变率极高,一般可达10%以上,另外,随着诱变剂量的提高突变频率也追加。二、淘汰野生菌株在诱变后的存活菌体中营养缺陷型菌株的数量很少,一般仅占存活菌体的百分之几或千分之几,而野生型细胞却大量存在,因而要采取一些措施,尽量淘汰野生型细胞,使缺陷型菌株得以富集,以利于检出。淘汰野生型菌株的方法有:抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。1、抗生素法:细菌用青霉素法:细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖,而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链,阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感,因而被抑制或杀死,但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上,培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死,营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来,达到富集目的。酵母菌用制霉素法:制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇,引起细胞膜的损伤,杀死生长繁殖过程的真菌,起到富集营养缺陷型的作用。2、菌丝过滤法真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝,而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中,振荡培养10h左右,使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见,用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养,每隔3~4h过滤一次,重复3~4次,最大限度地除去野生型细胞。然后稀释、涂皿分离。3、高温杀菌法利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异,让诱变后的细菌形成芽孢,然后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中,振荡培养一定时间,野生型芽孢萌发,而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80℃,维持一定时间,野生型细胞大部分被杀死,缺陷型则得以保留,起到了浓缩作用。营养缺陷型菌株的检出营养缺陷型菌株的检出方法有:点植对照法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等1、点植对照法:诱变后的孢子或菌体,经富集培养,涂布分离在完全培养基平板进行培养,待菌落孢子成熟后,用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置,同时培养,然后观察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落,可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上,进一步复证。该法可靠性强,但工作量大。2、夹层平板法:先在培养皿上倒一薄层基本培养基,凝固后再倒一层经过诱变处理的菌液,其上再浇一层基本培养基;经培养后,对首次出现的菌落用记号笔在皿底标记,然后再倒一层完全培养基,再培养,出现的形态